Avtomatizirana analiza

Transcription

1 Univerza v Ljubljani Fakulteta za kemijo in kemijsko tehnologijo Univerzitetni študijski program Kemija Izbirni sklop analizna in anorganska kemija Avtomatizirana analiza Seminar 2011 Predavatelj: prof. dr. Boris Pihlar Seminarska naloga je izdelana v okviru študijskih obvez dodiplomskega izbirnega predmeta Avtomatizirana analiza ( ). Delo ni lektorirano ali vsebinsko korigirano s strani predavatelja ali drugih univerzitetnih inštitucij. Avtor in inštitucija ne jamčita za pravilnost podatkov in navedb ter ne izključujeta možnosti, da so v objavljenem gradivu napake ali druge nepravilnosti. Gradivo predstavljeno v tem delu je avtorska lastnina, oziroma last navedenih virov, iz katerih je bilo povzeto.

2 UNIVERZA V LJUBLJANI FAKULTETA ZA KEMIJO IN KEMIJSKO TEHNOLOGIJO KATEDRA ZA ANALIZNO KEMIJO Elektro membranske ekstrakcije na čipu z online UV in masno spektrometrično detekcijo ( Seminarska naloga pri predmetu Avtomatizirana analiza) Avtorica: Kim Pjevović, 4.letnik Kemija Uni

3 Ljubljana, junij 2011 Mentor: prof. dr. Boris Pihlar KAZALO UVOD... 3 POVZETEK... 3 EKSTRAKCIJA TEKOČE-TEKOČE... 3 PRIPRAVA ELEKTRO MEMBRANSKEGA ČIPA... 4 EKSPERIMENTALNI DEL... 5 KEMIKALIJE IN RAZTOPINE VZORCEV... 5 KAPILARNA ELEKTROFOREZA... 7 ONLINE MERITVE Z UV DETEKCIJO... 8 ONLINE MERITVE Z ELEKTRORAZPRŠILNO IONIZACIJSKO MASNO SPEKTROMETRIJO... 8 PRESNOVA AMITRIPTILINA V MIKROSOMIH PODGANJIH JETER... 8 POTEKI, REZULTATI IN DISKUSIJA... 8 RAZISKOVANJE OBRATOVALNIH PARAMETROV... 8 ONLINE MERITVE Z UV DETEKCIJO: PREDKONCENTRACIJA S STOP-FLOW NAČINOM ONLINE MERITVE Z ELEKTRORAZPRŠILNO IONIZACIJSKO MASNO SPEKTROMETRIJO: EKSTRAKCIJA METADONA IZ URINA SPREMLJANJE PRESNOVE AMITRIPTILINA Z ELEKTRO MEMBRANSKO EKSTRAKCIJO NA ČIPU Z ELEKTRORAZPRŠILNO IONIZACIJSKO MASNO SPEKTROMETRIJO SKLEPI IN OBETI ZA PRIHODNOST VIRI

4 UVOD POVZETEK Elektro membranska ekstrakcija je bila izvedena v mikrofluidni napravi. Za opredelitev sistema so bili uporabljeni vzorci, ki so vsebovali zdravila kot so petidin, nortriptilin, metadon, haloperidol, loperamid in amitriptilin. Izkoristki ekstrakcije za različne analite so bili običajno v razponu od 65-86%, ko je naprava delovala s pretokom vzorca 2,0 µl/min in akceptorskim pretokom 1,0 µl/min. Med 12 min obratovanjem s pretokom vzorca 9,0 µl/min in akceptorskim pretokom 0,0 µl/min, so bili pridobljeni obogatitveni faktorji nad 75 od celotne prostornine vzorca, ki je znašala 108 µl. Elektro membranski sistem je bil povezan online z elektrorazpršilno ionizacijsko masno spektrometrijo in uporabljen za online spremljanje presnove amitriptilina v mikrosomih podganjih jeter. EKSTRAKCIJA TEKOČE-TEKOČE Veliko let se je ekstrakcija tekoče-tekoče uporabljala za pripravo vzorca pred kromatografijo in elektroforezo. Ta ekstrakcija temelji na različni topnosti in porazdeljevanju spojin iz zmesi v dveh topilih, ki se med seboj ne mešata. Običajno sta to voda in organsko topilo. Njena učinkovitost je določena s porazdelitvenim koeficientom in se jo da enostavno predvideti na podlagi molekularne strukture ciljnih analitov. Pogosto se uporablja ker je preprosta, hitra in učinkovita in zato, ker daje razumno očiščene vzorce. V zadnjih letih se je še bolj razvila in postala bolj prefinjena v različnih smereh. Te pomembne smeri vključujejo med drugim tudi razvoj tekočinsko-membranske ekstrakcije (SLM), tekočinsko-fazno mikroekstrakcijo (LPME), ki vsebuje prozorna, polipropenska votla vlakna in drop-to-drop tekočinsko-fazno mikroekstrakcijo. Druga pomemba smer je bila izvajanje ekstrakcije tekoče-tekoče za mikrofluidne čip naprave, bodisi z uporabo majhnih kapljic organskih topil ali na podlagi različnih membranskih pristopov. Največja spodbuda za slednje raziskave je bila izgradnja miniaturiziranega totalnega analiznega sistema (µ-tas) s celostnim vključevanjem priprave vzorca, ločitvijo in detekcijo na čipu. S takimi sistemi so lahko kemične analize opravljene na zelo majhnih količinah vzorca, z nizko porabo kemikalij in reagentov ter s hitro kinetiko. Slednje je posledica zelo kratke difuzijske poti v mikrofluidnih čip napravah. V zadnjem času so prvič dokazali elektro membransko ekstrakcijo (EME) na čipu. Ta sistem predstavlja nov način izvajanja podobnih načel, kot jih ima ekstrakcija tekočetekoče na mikrofluidnih čip napravah. Raztopine vzorcev, ki so vsebovale različna nepolarna zdravila so bile črpane v kanal za vzorec na čipu. Iz tega kanala so bili ekstrahirani modeli analitov skozi hidrofobne tekočinske membrane (SLM) v akceptorski rezervoar, ki se nahaja na čipu na drugi strani membrane. Gonilna sila za ekstrakcijo je bil enosmerni električni potencial, kjer je bila pozitivna elektroda (anoda) dana v kanal za vzorec, negativna elektroda (katoda) pa v akceptorski rezervoar. Vodni mediji na obeh straneh membrane so kisli, zdravila so bila torej 3

5 protonirana in so se razporedila po vsej membrani pod vplivom električnega polja. Namen membrane je bil zagotoviti hidrofobno pregrado med vzorcem in akceptorjem in to je povzročilo učinkovito čiščenje vzorcev urina. Namen električnega potenciala je bil povečati razporeditev osnovnih analitov v membrani na strani vzorca in iz membrane na akceptorski strani. Ker je bil zadrževalni čas vzorca na čipu le nekaj sekund, so bile ključnega pomena za dosego visoke učinkovitosti ekstrakcije hitre migracije analitov na membrani. Hitra migracija pa je bila dosežena z uporabo plitvih kanalov (kratke difuzijske razdalje). V prejšnjih sistemih za elektro membransko ekstrakcijo na čipu je bila akceptorska raztopina počasna in zato je bila po vsaki ekstrakciji ročno odstranjena s kapalko in analizirana offline s kapilarno elektroforezo. V tej raziskavi pa so hoteli pokazati nov pristop z uvedbo toka tudi v akceptorski kanal. S tem dinamičnim sistemom je bila akceptorska raztopina nepretrgoma črpana v UV detektor ali masni spektrometer za online analizo. PRIPRAVA ELEKTRO MEMBRANSKEGA ČIPA Vsak elektro membranski čip vsebuje pet posameznih kanalov za ekstrakcijo in je sestavljen iz dveh polimetilmetakrilatnih (PMMA) plošč (53 x 53 x 2,1 mm³). Na obeh ploščah je 6 mm dolg akceptorski kanal in kanal za vzorec. Globoka sta 50 µm in široka 2 mm. Na obeh koncih kanalov so skozi ploščo zvrtane 1,6 mm luknje, ki služijo za vstop in izstop za raztopino vzorca. Nad kanalom za vzorec je bila nameščena 25 µm debela porozna membrana iz polipropilena s 55% poroznostjo. Velikost por je bila 0,21 x 0,05 µm. Druga PMMA plošča je bila postavljena nad membrano tako, da sta se ujemala položaja kanala za vzorec in akceptorskega kanala. Vse to je bilo utrjeno in dano v peč na 70 C. Raztopini vzorca in akceptorja sta bili vbrizgani z dvema različnima brizgalnima črpalkama. Premer lukenj (1,6 mm) za dostop do kanala za vzorec in akceptorskega kanala onemogoča prisotnost mrtvega volumna. V luknje so neposredno vnesene politetrafluoroetilenske (PTFE), polietereterketonske (PEEK) ali jeklene cevi. Brizga, ki vsebuje akceptorsko raztopino je povezana z vstopom v rezervoar s cevjo iz nerjavečega jekla. Ta cev iz nerjavečega jekla pa prav tako služi kot katoda za elektro membransko ekstrakcijo. Kot anoda je služila platinasta žica, ki je bila vstavljena v 2 cm dolge politetrafluoroetilenske (PTFE) cevi v rezervoarju za izstop vzorca. Elektrodi sta bili povezani na generator enosmernega toka. Akceptorski izhodni rezervoar je online povezan z UV in masnim detektorjem (MS) s pomočjo kapilare iz kremenčevega stekla. Kapilara iz kremenčevega stekla je vstavljena v polietereterketonsko (PEEK) cev, kar omogoči, da kapilara ustreza 1,6mm luknji. Analiza ekstrakta je bila opravljena z online UV in elektrorazpršilno ionizacijsko masno spektrometrično detekcijo ali pa offline s kapilarno elektroforezo (CE) UV analizo. 4

6 Slika 1: Shematski prikaz elektro membranskega sistema na čipu EKSPERIMENTALNI DEL KEMIKALIJE IN RAZTOPINE VZORCEV Petidin hidroklorid (Pethidine hydrocloride) Je močno zdravilo za lajšanje hudih in stalnih bolečin, katere ne more nadzorovati nobeno drugo sredstvo za lajšanje bolečin. Lahko se uporablja tudi pred večjimi bolečimi operacijami in med porodom za zmanjšanje bolečine. Slika 2: Petidin hidroklorid Nortriptilin hidroklorid (Nortriptyline hydrochloride) Je zdravilo za lajšanje simptomov depresije Slika 3: Nortriptilin hidroklorid 5

7 Metadon hidroklorid (Methadone hydrochloride) Metadon je močan sintetični opijat, največkrat uporabljan za zdravljene odvisnosti od heroina in drugih opijatov. Ima blažilen učinek in je bil nekoč uporabljan kot sredstvo za blaženje bolečin. Slika 4: Metadon hidroklorid Haloperidol Je starejši antipsihotik, ki se uporablja za zdravljenje shizofrenije in še pogosteje za zdravljenje akutnih psihotičnih stanj in delirij. Slika 5: Haloperidol Loperamid hidroklorid (Loperamide hydrochloride) Je opioid, ki se uporablja za zdravljenje hujših oblik diareje. Slika 6: Loperamid hidroklori 6

8 Amitriptilin hidroklorid (Amitriptyline hydrochloride) Je antidepresiv, ki se uporablja za lajšanje simptomov depresije, pomaga pa tudi proti migrenam, napetosti, glavobolom, napadi tesnobe in nekaterim simptomom shizofrenije. Slika 7: Amitriptilin hidroklorid Vsa ta zdravila so bila pridobljena iz Sigma-Aldrichta (St. Louis, MO). 2-nitrofenil pentil eter (NPOE), 2,4-dimetil-1-nitrobenzen in 1-etil-2-nitrobenzen so bili pridobljeni iz Fluke (Buchs, Switzerland). Mikrosomi podganjih jeter (moški Sprague-Dawley, združena; 20 mg/ml; BD Biosciences, San Jose, CA) β nikotinamid adenin dinukleotid 2'-fosfat (NADPH) (Sigma Aldrich, St. Louis, MO) Osnovna raztopina je vsebovala 1 mg/ml petidina, nortriptilina, metadona, haloperidola in loperamida in je bila pripravljena v 10% etanolu ter shranjena in zaščitena pred svetlobo pri 4 C. Vzorec raztopine, ki je vseboval 5 spojin je bil pripravljen z redčenjem osnovne raztopine bodisi z 10 mm HCl, 100 mm mravljično kislino in 50 mm fosfatnim pufrom (ph 7,4) ali s človeškim urinom s 50% 100 mm mravljično kislino. HCl (10 mm) ali mravljična kislina (100 mm) sta bila uporabljena kot akceptorski raztopini. Osnovna raztopina za poskus s spremljanjem presnove je vsebovala 5 mm amitriptilina, 10 mm NADPH, 100 mm MgCl₂ in 1M pufer kalijevega fosfata (ph 7,4) in je bila pripravljena posebej v deionizirani vodi. KAPILARNA ELEKTROFOREZA Kapilarna elektroforeza (CE) je bila opravljena z Agilent Technologies HP³ CE instrumentom (Agilent Technologies, Waldbronn, Germany), ki je bil opremljen z UV detektorjem, ki je deloval pri 200 nm. Tekoči pufer je bil 25 mm natrijev dihidrogen fosfat s ph naravnanim na 2,7 s pomočjo ortofosforne kisline. Separacije so bile izvedene na 75 µm kapilari iz kvarčnega stekla z dejansko dolžino 24,5 cm. 7

9 ONLINE MERITVE Z UV DETEKCIJO Online meritve so bile opravljene z UV detektorjem Agilent Technologies HP³ CE instrumentom. Akceptorski kanal na izhodu iz čipa je bil povezan s 75 µm kapilaro iz kvarčnega stekla in ta kapilara je bila vezana na CE UV detektor. Zahtevana dolžina kapilare za dosego UV detektorja je bila 34 cm, vendar je bila ta dolžina z vrtanjem nove dostopne luknje za kapilaro v CE instrument uspešno skrajšana na 17 cm, kar je ustrezalo tudi volumnu 0,75 µl. Zamuda od ekstrakcijske celice do UV detektorja s pretokom 3 µl/min je bila 15 s. ONLINE MERITVE Z ELEKTRORAZPRŠILNO IONIZACIJSKO MASNO SPEKTROMETRIJO Doma narejen nanorazpršilni vmesnik je služil za spojitev ESI-MS. 50 µ kapilara iz kvarčnega stekla je bila zaostrena tako, da so konico kapilare najprej dali v plamen in medtem ko so vpihovali zrak skozi kapilaro, je bil razpršilni vrh jedkan v 48% fluorovodikovi kislini. Kapilara je bila zmanjšana na dolžino 15 cm in vstavljena v izhodni rezervoar akceptorskega kanala preko polietereterketonskega (PEEK) rokava cevi in pritrjena z lepilom. Razpršilna kapilara je bila vgrajena v doma narejen CE- ESI-MS vmesnik, ki je bil vgrajen neposredno pred vhod MS. Akceptorska raztopina, ki je služila za online priključitev na MS je bila 100 mm mravljična kislina, ki je bila dovedena pri pretoku 0-6 µl/min. Visoke napetosti za ESI so bile pridobljene iz MS instrumenta z upravljanjem plošče ob MS vhodu pri - 4,5 kv, medtem ko je bila razpršilna kapilara prizemljena na akceptorski kanal. Občutljivost je bila nekoliko izboljšana ko je razpršilec upravljal z razpršilnim plinom (dušik), ki je deloval pri 50 psi. Volumen razpršilne kapilare je bil 0,3 µl. Delovanje z akceptorskim pretokom 3 µl/min je ustrezalo zamudi 6 s od ekstrakcijske naprave. PRESNOVA AMITRIPTILINA V MIKROSOMIH PODGANJIH JETER Presnova je bila izvedena tako, da so pripravili reakcijsko raztopino iz 1 mg/ml mikrosomov podganjih jeter, 50 µm amitriptilina, 5 mm MgCl₂ in 100 mm kalijevega fosfata (ph 7,4). Presnova se je začela z dodajanjem NADPH k reakcijski mešanici. Presnova je bila izvedena online v 1000 µl brizgi neprepustni za plin pod nadzorovano temperaturo 37 C. Brizga je bila povezana z EME čipom s pomočjo 8 cm dolge polietereterketonske (PEEK) cevi s skupnim mrtvim volumnom 2 µl. Brizgalna črpalka je neprestano črpala reakcijsko raztopino do čipa pri pretoku 9 µl/min. POTEKI, REZULTATI IN DISKUSIJA RAZISKOVANJE OBRATOVALNIH PARAMETROV Petidin, nortriptilin, metadon, haloperidol in loperamid so bili izbrani kot glavni modeli analitov za študijo. Modeli analitov so bila vsa osnovna zdravila relativno nizkih polarnosti. Raztopino vzorca je sestavljalo primarno 5 modelnih analitov raztopljenih 8

10 v 10 µg/ml 10 mm HCl. HCl je služil kot elektrolit v vzorcu za zagotovitev, da so bili modeli analitov protonirani. Raztopino vzorca so črpali v čip s pretokom v območju 1,75-12,0 µl/min, akceptorsko raztopino pa s pretokom 0,23-3,0 µl/min. Razmerje med vzorčno in akceptorsko stopnjo pretoka je močno vplivalo na obogatitveni faktor, v nekaterih primerih pa so pretok celo ustavili (stop-flow način) za doseganje najvišjih možnih obogatitvenih faktorjev. Enosmerna napetost v območju od -2 do +30 V je bila uporabljena po celotni SLM in je služila kot gonilna sila za ekstrakcijo. Akceptorska raztopina se je zbirala na izhodu akceptorskega kanala in je bila analizirana offline s kapilarno elektroforezo za pridobitev točnih količinskih informacij o ekstrakciji petih analitov pri različnih pretokih in napetostih. Pri prvem eksperimentu je bilo delovanje sistema karakterizirano z različnimi pretoki za ratopino vzorca. Stopnja pretoka vzorca se je spreminjala v razopnu 1,75-4,0 µl/min medtem, ko je bila stopnja pretoka akceptorja konstantna pri 1,0 µl/min (Slika 2). Za okrevanje je bilo ugotovljeno, da je bilo približno konstantno pri najnižji hitrosti pretoka in je začelo padati pri pretokih višjih od 2,0 3,0 µl/min. Ko se je pretok povečal, se je povprečni zadrževalni čas v vzorčnem kanalu zmanjšal in je znašal približno 16 s za pretok pri 3,0 µl/min. Okrevanje pridobljeno s tem dvotokovnim sistemom pa je bilo boljše od prejšnjih rezultatov, ki so bili objavljeni za podoben sistem na čipu, ki je bil upravljan z isto stopnjo pretoka vzorca, vendar z mirujočo akceptorsko raztopino. Okrevanje pridobljeno s pretokom vzorca 3,0 µl/min v okviru njihove raziskave je ustrezalo 80% za nortriptilin, v prejšnjih raziskavah pa samo 34%. Podobno je okrevanje za vse druge analite prav tako narastlo: metadon iz 41% na 85%, haloperidol iz 37% na 79%, loperamid iz 52% na 86% in petidin iz 12% na 52% Slika 2: Okrevanje ekstrakcije v odvisnosti od pretoka vzorca (SLM = 2-nitrofenil oktil eter (NPOE); vzorec = 10 mm HCl, ki vsebuje 5 zravil, vsakega po 10 µg/ml; akceptor = 1,0 µl/min 10 mm HCl, napetost = 15 V; čas ekstrakcije = 7 min. Okrevanja so bila določena z off čip CE ločitvijo 9

11 Vpliv različnih pretokov za akceptorsko raztopino je bil karakteriziran v območju od 0,25 2,0 µl/min medtem, ko je bil pretok vzorca konstanten na 3,0 µl/min. Okrevanja so bila skoraj neodvisna od stopnje pretoka akceptorja in so bila 80% za nortriptilin, metadon, haloperidol in loperamid ter 45% za petidin. Rezultati so pokazali, da pretok akceptorja ni imel bistvenega vpliva na okrevanje za delovanje v območju 0,25 2,0 µl/min. Večje okrevanje v tem sistemu v primerjavi s prejšnjim sistemom s stagnirano akceptorsko raztopino je verjetno posledica tega, da so bile uporabljene pretočne razmere v akceptorskem kanalu in širše območje SLM v stiku z akceptorsko raztopino. V tem sistemu je imela akceptorska raztopina stično območje vzdolž celotnega kanala za vzorec, ki ustreza 16 mm², v primerjavi s stično površino le 3,14 mm² v prejšnjem sistemu, kjer je površje bilo določenos premerom akceptorskega rezervoarja. Slika 3: Obogatitveni faktor v odvisnosti od stopnje pretoka akceptorja (SLM = 2- nitrofenil oktil eter (NPOE); vzorec = 3,0 µl/min 10 mm HCl, ki vsebuje 5 zravil, vsakega po 10 µg/ml; akceptor = 10 mm HCl, napetost = 15 V; čas ekstrakcije = 7 min. Okrevanja so bila določena z off čip CE ločitvijo Pri pretoku akceptorske raztopine 0,25 µl/min, so bili 4 modeli analitov predkoncentrirani s faktorjem od 9,6 do 10,2 z 21,0 µl vzorca (doveden pri 3 µl/min). To je pokazalo, da predkoncentracijo zlahka prilagodimo s spremembo razmerja med stopnjo pretoka vzorca in akceptorske raztopine. Ko je bila napetost ekstrakcije optimizirana za ustrezne modele analitov (Slika 4), so opazili še eno zanimivo lastnost dvopretočnega EME sistema na čipu. V tem primeru je napetost nihala med -2 in 20 V in vsa okrevanja so se povečala, ko se je povečala napetost iz 0 na 10 V. Ko pa se je napetost povečala iz 10 na 20 V so vsa okrevanja ostala nespremenjena. Tako je za učinkovito ekstrakcijo zadostovalo 10 V, vendar pa je bilo odločeno, da bo sistem deloval pri 15 V zato, da morebitne razlike v prevodnosti vzorca ne bi vplivale na delovanje sistema. 10

12 Slika 4: Okrevanje ekstrakcije v odvisnosti od napetosti (SLM = 2-nitrofenil oktil eter (NPOE); vzorec = 3,0 µl/min10 mm HCl, ki vsebuje 5 zravil, vsakega po 10 µg/ml; akceptor = 1,0 µl/min 10 mm HCl; čas ekstrakcije = 7 min. Okrevanja so bila določena z off čip CE ločitvijo. Vse ekstrakcije so bile opravljene na isti napravi po naključnem vrstnem redu. Dvopretočni EME sistem na čipu je bil tudi karakteriziran z različnimi organskimi topili, kot SLM. Rezultati so povzeti v Preglednici 1. Kot je razvidno iz rezultatov, so bili najboljši rezultati pridobljeni z 2-nitrofenil oktil eterom (NPOE) in prav to topilo je bilo uporabljeno skozi celotno študijo. Preglednica 1: Okrevanje z uporabo različnih organskih topil V zadnjem poskusu v tem sklopu, so preizkusili alternativne elektrolite v raztopini vzorca in akceptorski raztopini. Za raztopino vzorca je bil 10 mm HCl nadomeščen s 100 mm mravljično kislino (ph 2) in 100 mm pufrom kalijevega fosfata (ph 7,4). Kot je razvidno v Preglednici 2 so vsi trije elektroliti v vzorcu zagotovili zelo visoka okrevanja pri 15 V. Za akceptorsko raztopino pa je bil 10 mm HCl nadomeščen s 100 mm mravljično kislino. 100 mm mravljična kislina kot akceptorska raztopina je delovala prav tako učinkovito. 11

13 Preglednica 2: Okrevanja z uporabo alternativnih elektrolitov v raztopini vzorca in akceptorski raztopini ONLINE MERITVE Z UV DETEKCIJO: PREDKONCENTRACIJA S STOP- FLOW NAČINOM V naslednji seriji eksperimentov je bil akceptorski izhod iz EME sistema na čipu online vezan na UV detektor, ki je deloval pri 200 nm. Injektor z zanko je bil ustavljen v pretok vzorca pred čip. Brizgalna črpalka je neprestano črpala 9 µl/min 10 mm HCl skozi injektor z zanko v kanal za vzorec EME sistema na čipu. Vzorci obogateni z 1, 2, 5, 10 in 20 µg/ml metadona v 10 mm HCl so bili vbrizgani v pretok. Volumen injektorja z zanko je bil 20 µl in je pri pretoku 9 µl/min ustrezal skupnemu zadrževalnemu času v ekstrakcijskem čipu za 2,2 min. Za akceptorsko raztopino je bil uporabljen 10 mm HCl s pretokom 3,0 µl/min. UV signal vzorca po ekstrakciji detektiran pri 200 nm je bil linearno povezan s koncentracijo metadona v prvotnem vzorcu. V naslednji seriji eksperimentov so za testiranje potenciala za visoko koncentrirane analite v akceptorskem kanalu med ekstrakcijo ustavili tok. Vzorec je sestavljalo 0,3 µg/ml metadona in 10 mm HCl. Vzorec je bil črpan v sistem s pretokom 9,0 µl/min za 2, 3, 4, 5, 7, in 12 min. Po ekstrakciji je bil akceptorski tok (3,0 µl/min) uveden za prenos koncentriranega vzorca do UV detektorja. Širina vrha merjenega na polovici višine, ko so koncentrirani vzorci šli skozi UV detektor je bila samo 0,2 min, kar ustreza volumnu vzorca 0,6 µl. Tako območje kot višina vrha sta se linearno povečevala s časom. Koncentracijski faktor metadona, ki temelji na povišanju višine vrha, je bil približno 27 za 4 minutno in 76 za 12 minutno ekstrakcijo. ONLINE MERITVE Z ELEKTRORAZPRŠILNO IONIZACIJSKO MASNO SPEKTROMETRIJO: EKSTRAKCIJA METADONA IZ URINA Dvopretočni EME sistem na čipu je bil tudi neposredno povezan z elektrorazpršilno ionizacijsko masno spektrometrijo (ESI-MS). Struktura je bila identična kot pri eksperimentih prej le, da je UV detektor bil nadomeščen z ESI-MS. Brizgalna črpalka je nenehno črpala 9,0 µl/min 100 mm mravljične kisline skozi injektor z zanko v vzorčni kanal EME sistema na čipu. Različni vzorci urina obogateni z 0.1, 0.25, 1.0, 2.0, 5.0 in 10.0 µg/ml metadona so bili vbrizgani v pretok. Volumen injektorja z 12

14 zanko je bil 20 µl in je pri pretoku 9 µl/min ustrezal skupnemu zadrževalnemu času v ekstrakcijskem čipu za 2,2 min. Akceptorska raztopina, ki je vsebovala 100 mm mravljične kisline je bila dovedena s pretokom 3,0 µl/min. MS signal za metadon je meril m/z = 310 in je linearno povezan s koncentracijo v izvirnem vzorcu v območju 0,1 10,0 µg/ml z r² vrednostjo 0,995. Meja zaznavnosti za metadon v urinu je znašala 40 ng/ml. Ta vrsta neposredne meritve metadona v urinu je bila mogoča le po EME na čipu, zato ker je EME vzorec razsolil in odstranil večino drugih komponent matriksa. Brez EME na čipu bi bil MS signal m/z = 310 popolnoma prekrit z matriksom urina. SPREMLJANJE PRESNOVE AMITRIPTILINA Z ELEKTRO MEMBRANSKO EKSTRAKCIJO NA ČIPU Z ELEKTRORAZPRŠILNO IONIZACIJSKO MASNO SPEKTROMETRIJO V zadnjem poskusu je bil EME sistem na čipu povezan online z ESI-MS in uporabljen za študijo presnove amitriptilina v mikrosomih podganjih jeter. Mikrobrizga je bila napolnjena s suspenzijo mikrosomov podganjih jeter, MgCl₂, pufrom kalijevega fosfata (ph 7,4), amitriptilinom kot substratom in NADPH kot kofaktorjem. Nameščena je bila v večjo plastično brizgo, ki je služila kot kopel za vzdrževanje temperature na 37 C. Konec mikrobrizge je bil povezan z vstopom v EME sistem na čipu. Ko se je reakcija presnove začela z uvedbo kofaktorja NADPH v reakcijsko mešanico, je mikrobrizga začela nepretrgoma dovajati reakcijsko mešanico na EME sistem na čipu s pretokom 9,0 µl/min. Amitriptilin in metaboliti so bili ekstrahirani z 15 V v akceptorsko raztopino 100 mm mravljične kisline, ki je bila uvedena s pretokom 3,0 µl/min. Akceptorski tok je bil usmerjen v ESI-MS sistem za stalno spremljanje presnove v realnem času. Rezultat enega izmed poskusov je prikazan na Sliki 5, kjer so MS signali amitriptilina in nekaterih metabolitov narisani v odvisnosti od reakcijskega časa. Prve minute presnove nismo spremljali, saj je bila uporabljena za mešanje NADPH z reakcijsko mešanico v brizgi in da sproži pretok proti EME napravi. Kot je razvidno iz Slike 5, se je koncentracija amitriptilina med poskusom zmanjšala (m/z = 278) in očitno sledi kinetiki prvega reda. Razpolovni čas za amitriptilin je bil ocenjen na 4,75 min na podlagi petih ponovitev meritev (RSD = 5,7%). Faza I metabolitov nortriptilina pri m/z = 264 in 10-hidroksiamitriptilina pri m/z = 294, se je hitro povečala skozi začetno fazo poskusa, koncentracija metabolitov v I fazi 10-hidroksinortriptilina pri m/z = 280 pa se je razvijala bolj počasi. Po 22 min se je poskus zaključil. EME sistem na čipu je bil pomemben za uspeh online poskusa. SLM je služila kot online filter za odstranjevanje trdnih delcev iz mikrosomov podganjih jeter in preprečila njihov vstop v ESI-MS sistem. Za te trdne delce je bilo ugotovljeno, da ne zlepijo kanalov na čipu. Prav tako pa hidrofobne lastnosti SLM preprečijo prisotnim solem v reakcijski mešanici, da bi vstopile v ESI-MS sistem. Pomembno je tudi razsoljevanje vzorca pred ESI-MS zato, da se izognemo prekrivanju MS signalov. 13

15 Slika 5: MS signali amitriptilina in metabolitov v odvisnosti od reakcijskega časa presnove (SLM = 2-nitrofenil oktil eter (NPOE); pretok vzorca = 9,0 µl/min; akceptor = 3,0 µl/min 100 mm mravljična kislina; napetost = 15 V. Prikazani so amitriptilin (m/z 278), 10-hidroksiamitriptilin (m/z 294), nortriptilin (m/z 264) in 10- hidroksinortriptilin (m/z 280) SKLEPI IN OBETI ZA PRIHODNOST Delo na elektro membranski ekstrakciji na čipu se je za prvič pokazalo kot dinamično, saj sta bili tako vzorčna kot tudi akceptorska raztopina konstantno dovajani na čip z mikrobrizgalno črpalko. Ko je bil pretok akceptorske raztopine vklopljen, je bila na sistemu omogočena neprekinjena ekstrakcija in online merjenje z UV ali MS detekcijo. Z zmanjšanjem pretoka akceptorske raztopine glede na pretok vzorca je sistemu omogočena signifikantna predkoncentracija. Pretok akceptorske raztopine je bil celo izključen in je tako sistemu omogočil več kot 75-kratno obogatitev analita iz 108 µl vzorca. Podprta tekočinska membrana (SLM), ki ločuje vzorec in akceptorsko raztopino igra ključno vlogo v sistemu, saj onemogoča vstop trdnim delcem, solem in mnogim drugim sestavinam matriksa vstop v akceptorsko raztopino. Tako SLM zelo učunkovito očisti vzorce kompleksnih bioloških tekočin. To je bilo še posebej pomembno za online povezovanje na MS, saj so se tako izognili prekrivanjem MS signalov. Potencial tega novega tipa tehnologije je bil na kratko predstavljen z neprekinjenim online merjenjem presnove amitriptilina v mikrosomih podganjih jeter. V primerjavi z votlimi vlakni LPME, je sedanji sistem nudil možnost neprekinjene ekstrakcije in online meritev. Poleg tega sedanji sistem predstavlja dodatno zmanjšanje velikosti votlih vlaken LPME in tradicionalne SLM ekstrakcije, ki je boljša za rokovanje in za ekstrakcijo zelo majhnih volumnov vzorca. Tako so lahko analiti z elektro membransko ekstrakcijo na čipu zlahka obogateni iz nizkih mikroliterskih volumnov v zelo kratkem času. Vendar pa je v prihodnje potrebnega veliko dela za razvoj in karakterizacijo tehnike ter za razvoj ključnih aplikacij. 14

16 VIRI Nickolaj Jacob Petersen, Sunniva Taule Foss, Henrik Jensen, Steen Honore Hansen, Christian Skonberg, Detlef Snakenborg, Jorg P. Kutter and Stig Pedersen-Bjergaard; On-Chip Electro Membrane Extraction with Online Ultraviolet and Mass Spectrometric Detection; Analytical Chemistry, Vol. 83, No. 1, January 1, Hydrochloride