VAISTINIŲ MELISŲ IŠTRAUKŲ TECHNOLOGIJA IR KOKYBĖS VERTINIMAS

LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS MEDICINOS AKADEMIJA FARMACIJOS FAKULTETAS KLINIKINĖS FARMACIJOS KATEDRA TOMA RAIŠYTĖ VAISTINIŲ MELISŲ IŠTRAUKŲ TECHNOLOGIJA IR KOKYBĖS VERTINIMAS Magistro baigiamasis darbas Darbo vadovas prof. dr. K. Ramanauskienė Kaunas, 2014

2 LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS MEDICINOS AKADEMIJA FARMACIJOS FAKULTETAS KLINIKINĖS FARMACIJOS KATEDRA TVIRTINU: Farmacijos fakulteto dekanas Vitalis Briedis Data: VAISTINIŲ MELISŲ IŠTRAUKŲ TECHNOLOGIJA IR KOKYBĖS VERTINIMAS Magistro baigiamasis darbas Darbo vadovas: Kristina Ramanauskienė Data: Recenzentas Data: Darbą atliko: Magistrantė Toma Raišytė Data: Kaunas, 2014

3 TURINYS SANTRAUKA... 5 SUMMARY... 6 SANTRUMPŲ SĄRAŠAS... 8 ĮVADAS... 9 DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI... 10 1.LITERATŪROS APŽVALGA... 11 1.1.Vaistinių melisų (lot. Melissa officinalis) bendra charakteristika... 11 1.2.Vaistinių melisų žaliavos cheminė sudėtis... 11 1.2.1.Polifenoliniai junginiai augalinėje žaliavoje... 12 1.3.Vaistinių melisų biologinis poveikis ir pritaikymas medicinos praktikoje... 14 1.4.Vaistinių melisų preparatai, esantys Lietuvos rinkoje... 17 1.5.Užpilai, nuovirai, tinktūros ir ekstraktai. Jų technologija bei analizės metodai... 18 1.6.Ekstrahentų, naudojamų augalinių ištraukų gamyboje, charakteristikos... 20 2.TYRIMO METODIKA IR METODAI... 22 2.1.Tyrimuose naudotos medžiagos... 22 2.2.Vaistinių melisų (lot. Melissa officinalis) tinktūrų technologija... 22 2.3.Vaistinių melisų (lot. Melissa officinalis) ekstraktų technologija... 24 2.4.Vaistinių melisų (lot. Melissa officinalis) etanolinių ištraukų gamyba ekstrahuojant ultragarsu... 25 2.5.Vaistinių melisų (lot. Melissa officinalis) arbatos technologija... 25 2.6.Vaistinių melisų (lot. Melissa officinalis) etanolinių ir vandeninių ištraukų analizės metodai... 26 2.6.1.Sauso likučio kiekio nustatymas... 26 2.6.2.Suminio polifenolinių junginių kiekio nustatymas pagal p-kumaro rūgšties ekvivalentą spektrofotometriniu metodu... 26 2.6.3.Vaistinių melisų (lot. Melissa officinalis) tinktūrų antimikrobinio aktyvumo vertinimas.... 27 3.REZULTATAI... 28 3.1.Vaistinių melisų (lot. Melissa officinalis) tinktūrų kokybės vertinimas... 28 3.1.1.Ekstrahento įtaka vaistinių melisų tinktūrų (1:5) kokybei... 28 3.1.2.Ekstrahavimo metodo įtaka melisų tinktūrų (1:5) kokybei... 29 3.2.Vaistinių melisų (lot. Melissa officinalis) ekstraktų kokybės vertinimas... 34 3.2.1Ekstrahento įtaka melisų ekstraktų (1:1) kokybei... 34 3.2.2.Ekstrahavimo metodo įtaka melisų ekstraktų (1:1) kokybei... 35

4 3.3.Žaliavos ir ekstrahento santykio įtaka melisų ištraukų kokybei... 41 3.3.1.Žaliavos ir ekstrahento santykio įtaka melisų ištraukų kokybei gaminant maceracijos metodu.. 41 3.3.2.Žaliavos ir ekstrahento santykio įtaka melisų ištraukų kokybei ekstrahuojant ultragarsu... 43 3.4.Vaistinių melisų (lot. Melissa officinalis) vandeninių ištraukų kokybės vertinimas... 44 3.5.Vaistinių melisų (lot. Melissa officinalis) tinktūrų antimikrobinis aktyvumas... 46 IŠVADOS... 48 PRAKTINĖS REKOMENDACIJOS... 49 PUBLIKACIJOS MAGISTRO BAIGIAMOJO DARBO TEMA... 50 LITERATŪROS SĄRAŠAS... 51

5 SANTRAUKA T. Raišytės magistro baigiamasis darbas/ mokslinė vadovė prof. dr. K. Ramanauskienė; Lietuvos sveikatos mokslų universiteto, Farmacijos fakulteto, Klinikinės farmacijos katedra. Kaunas. VAISTINIŲ MELISŲ IŠTRAUKŲ TECHNOLOGIJA IR KOKYBĖS VERTINIMAS Darbo tikslas: Pagaminti vaistinių melisų ištraukas ir įvertinti jų kokybę. Darbo uždaviniai: 1. Remiantis mokslinės literatūros duomenimis parinkti tinkamą vaistinių melisų skystą vaisto formą, atsižvelgiant į veikliosios medžiagos farmakologines savybes bei parinkti analizės metodus preparatų kokybei įvertinti; 2. Nustatyti ekstrahento (etanolio ir vandens) įtaką melisų ištraukų kokybei; 3. Palyginti ekstrahavimo metodo daromą įtaką vaistinių melisų ištraukų kokybei; 4. Ištirti žaliavos ir ekstrahento santykio daromą įtaką vaistinių melisų ištraukų kokybei. Metodika: 1. Tyrimo objektas vaistinių melisų ištraukos; 2. Vaistinių melisų vandeninių ir etanolinių ištraukų technologija: a) Ištraukos gamintos klasikinės maceracijos ir perkoliacijos metodais; b) Etanolinės ištraukos gamintos ekstrahuojant ultragarsu ir kokybė vertinama po 20 min., 30 min. ir 40 min. ekstrahavimo; 3. Taikytas spektrofotometrinis metodas pagal Folin Ciocalteau metodiką, norint nustatyti suminį polifenolinių junginių kiekį pagal KRE; 4. Sauso likučio tyrimas atliktas gravimetriniu metodu; 5. Antimikrobinis aktyvumas nustatytas pagal Ph. Eu. 01/2002, 2.6.12 metodiką. Rezultatai: Spektrofotometriniu metodu nustatyta, kad ekstrahentas turi įtakos veikliųjų junginių išsiskyrimui: didesnis suminis polifenolinių junginių bei sauso likučio kiekis nustatytas, kai ekstrahentu pasirenkamas etanolis, o ne vanduo. Vertinant etanolio koncentraciją nustatyta, kad mažiausiai veikliųjų junginių išsiekstrahuoja naudojant 70 proc. etanolį, o daugiausiai - 40 ir 50 proc. etanolį. Technologinis metodas taip pat turėjo įtakos vaistinių melisų ištraukų kokybei. Daugiausiai veikliųjų junginių nustatyta, technologijai pasirinkus ekstrahavimą ultragarsu, 30 min. Ištraukų kokybei reikšmės turi ir žaliavos bei ekstrahento santykis skystuosiuose ekstraktuose, pagamintuose santykiu 1:1, nustatytas didesnis veikliųjų junginių kiekis, lyginant su tinktūromis, kai santykis 1:5. Išvados: 1. Tyrimų rezultatai parodė, jog ekstrahentu naudojant vandenį, veikliųjų junginių nustatyta mažiau, nei naudojant etanolį. Nustatyta, kad etanolio koncentracija turi įtakos veikliųjų junginių išsiekstrahavimui didžiausias suminis polifenolinių junginių kiekis ir sausas likutis nustatytas ištraukose, kai etanolio koncentracija yra 50 ar 40 proc.; 2. Eksperimentinių tyrimų metu nustatyta, jog ekstrahavimo metodas daro įtaką melisų ištraukų kokybei. Tinkamiausias ekstrahavimo metodas melisų skystųjų ekstraktų ir tinktūrų gamyboje yra ekstrahavimas ultragarsu. Rekomenduojama ekstrahavimo trukmė 30 min.; 3. Tyrimų rezultatai parodė, jog žaliavos ir ekstrahento santykis turi įtakos ištraukų kokybei. Didesnis veikliųjų junginių kiekis nustatytas skystuosiuose melisų ekstraktuose, pagamintuose santykiu 1:1, lyginant su melisų tinktūromis, pagamintomis santykiu 1:5; 4. Tyrimų metu nustatyta, jog vaistinių melisų tinktūros pasižymi antimikrobiniu aktyvumu. Labiausiai jautrios yra S. aureus bei K. pneumoniae, o labiausiai atspari C. albicans. Praktinės rekomendacijos: 1. Gaminant etanolines vaistinių melisų ištraukas, rekomenduojama rinktis skystuosius ekstraktus, pagamintus santykiu 1:1, kai ekstrahentas yra 40 ar 50 proc. etanolis; 2. Vandeninės melisų ištraukos yra tinkama profilaktikos priemonė kasdieniam vartojimui; 3. Vaistinių melisų tinktūros yra rekomenduojamos kaip išorinė vaisto forma.

6 SUMMARY THE ANALYSIS OF QUALITY AND TECHNOLOGY OF EXTRACTS OF MELISSA OFFICINALIS Purpose of work: To make and evaluate the quality of Melissa officinalis extracts. Tasks of work: 1. According to the scientific literature to identify an appropriate Balm liquid dosage form according to the pharmacological properties of the active material and the selection of analytical methods for evaluating the quality of products; 2. To set an extraction solvent (ethanol and water) influence on the quality of extracts of Melissa officinalis; 3. To compare extraction method influence on the quality of extracts of Melissa officinalis; 4. To investigate the relationship between the raw material and extraction solvent influence on the quality of extracts of Melissa officinalis. Methods: 1. Object of analysis extracts of Melissa officinalis; 2. Preparation of an aquous and ethanolic extracts: a) Extracts have been produced by tradicional maceration and percolation methods; b) Ethanol extracts have been produced by extraction by ultrasound. The quality of these extracts has been evaluated after 20, 30, 40 min. 3. Spectrophotometric method (Folin Ciocalteua method) common amount of total polyphenolic compounds by p-cumaric acid equivalent has been evaluated; 4. The evaluation of dry residual according to gravimetric analysis has been calculated; 5. Antimicrobial activity by Ph. Eu. 01/2002, 2.6.12 method has been evaluated. Results: By spectrophotometric method it has been evaluated that extrahent has the influence on active compounds emission: higher amount of total polyphenolic compounds and dry residue have been evaluated when extrahent is ethanol. Concentration of ethanol has influence too: the lowest amount of active compounds has been evaluated when ethanol concentration is 70 percent, the highest amount is with 40 or 50 percent ethanol. Method of technology has the influence on quality of extracts of Melissa officinalis also. The best technological method for extracts of Melissa officinalis is extraction by ultrasound. Test results show, that the time of extraction has influence on extracts quality of Melissa officinalis the highest amount of extractives has been evaluated when the time of extraction is 30 min. It has been shown, that ratio of herbal raw materials and volume of extrahent has influence on quality of extracts too - the highest amount of extractives has been evaluated when ratio is 1:1. Conclusions: 1. Test results show, that when extrahent is water, amount of extractives is significant lower than extrahent is ethanol. It has been evaluated, that the most suitable ethanol concentration is 40 or 50 percent. 2. Experimental tests show, that the best method of technology is extraction by ultrasound, when extraction time 30 min.; 3. Test results show, that is very important to choose the most suitable method of technology for ratio of herbal raw materials and volume of extrahent; 4. Test results show, that tictures of Melissa officinalis have antimicrobial activity. The most sensitive are S. aureus and K. pneumoniae and the most resistant is C. albicans. Practice recommendation: 1. Prepaired ethanolic extracts of Melissa officinalis it is recommented to choose liquid extracts (1:1), when extrahent is 40 or 50 percent ethanol; 2. Aqous extracts of Melissa officinalis is recommended for daily use; 3. Tinctures of Melissa officinalis is recommended like external drug form.

7 PADĖKA Už suteiktas kokybiškas darbo sąlygas ir materialinę bazę atlikti mokslinį tiriamąjį darbą tema Vaistinių melisų ištraukų technologija ir kokybės vertinimas dėkoju prof. dr. K. Ramanauskienei bei visam Klinikinės farmacijos katedros kolektyvui. Už antimikrobinio aktyvumo tyrimų įgyvendinimą dėkoju Vaistų chemijos katedros docentei Vilmai Petrikaitei.

8 SANTRUMPŲ SĄRAŠAS KRE p-kumaro rūgšties ekvivalentas; r. rūgštis; Ach acetilcholinas; CD cukrinis diabetas; EMEA Europos medicinos agentūra; GABA-T gama amino butirinės rūgšties transaminazė; RA rozmarininė rūgštis; ESC efektyvioji skysčių chromatografija; ŽIV žmogaus imunodeficito virusas; TSH tiroidus stimuliuojantis hormonas; CNS centrinė nervų sistema; COX ciklooksigenazė; LOX lipoksigenazė; Pg prostaglandinai; Lt leukotrienai; Ph. Eur. Europos farmakopėja; UAB uždaroji akcinė bendrovė; MSK minimali slopinanti koncentracija; VAŽ vaistinė augalinė žaliava.

9 ĮVADAS Vaistinės melisos (lot. Melissa officinalis L.) yra vienos iš seniausių, tačiau vis dar vienos iš populiariausių vaistinių augalų [29]. Jau nuo senų laikų ši vaistažolė buvo vartojama nerimo bei nemigos gydyme. Šiandieninėje mokslinėje literatūroje randame vis daugiau duomenų apie šių vaistinių augalų cheminę sudėtį ir kur kas platesnį jų pritaikymą medicinos praktikoje. Didelis mokslininkų dėmesys yra skiriamas vaistinių melisų sudėtyje esantiems polifenoliniams junginiams, kurie ir nulemia daugelį vaistinių melisų poveikių. Šiuolaikinės mokslinės studijos labiausiai orientuotos į vaistinių melisų pritaikymą Alzheimerio ligai, taip pat Herpes simplex viruso gydymui, plačiai tiriamos antioksidacinės šio vaistinio augalo savybės. Todėl studijuojant mokslinę literatūrą, planuojama pateikti išsamesnę ir koncentruotą informaciją apie vaistinių melisų pritaikymą šių ir kitų ligų gydyme, analizuoti ir interpretuoti gautus rezultatus. Tam, kad būtų atskleistos vaistinių melisų terapinės savybės, būtina parinkti tinkamą vaisto formą. Remiantis mokslinėmis publikacijomis, kaip viena iš formų gali būti pasirenkamos skystos vaistinių melisų vaisto formos, tokios kaip tinktūros ar ekstraktai, užpilai ar nuovirai. Tikslinga atlikti tyrimus, kurie padėtų išsiaiškinti, kokios etanolinės ar vandeninės melisų ištraukos yra tinkamesnės vartoti į vidų ar išoriškai. Temos aktualumas. Moksliniu požiūriu aktualu tai, kad vaistinės melisos pasižymi bakteriostatiniu, antimikrobiniu, antioksidaciniu ir antivirusiniu poveikiu, kas lemia jų pritaikymą įvairių ligų gydyme ir prevencijoje. Todėl tikslinga atlikti tyrimus, kuriais būtų galima įvertinti šių vaistažolių kokybę. Aktualu vertinti ekstrahento įtaką vaistinių melisų kokybei, taip pat ištraukų paruošimo technologijas, kurios garantuotų optimalų veikliųjų junginių išsiekstrahavimą bei žaliavos ir ekstrahento santykio įtaką siekiant išgauti kuo didesnius veikliųjų junginių kiekius. Tyrimo problema: skystos vaistinių melisų vaisto formos parinkimas, tinkamiausios technologijos pritaikymas ir kokybės vertinimas. Darbo tikslas: pagaminti vaistinių melisų ištraukas ir įvertinti jų kokybę.

10 DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI Darbo tikslas: pagaminti vaistinių melisų ištraukas ir įvertinti jų kokybę; Darbo uždaviniai: 1. Remiantis mokslinės literatūros duomenimis parinkti tinkamą vaistinių melisų skystą vaisto formą, atsižvelgiant į veikliosios medžiagos farmakologines savybes bei parinkti analizės metodus preparatų kokybei įvertinti; 2. Nustatyti ekstrahento (etanolio ir vandens) įtaką vaistinių melisų ištraukų kokybei; 3. Palyginti ekstrahavimo metodo daromą įtaką vaistinių melisų ištraukų kokybei; 4. Ištirti žaliavos ir ekstrahento santykio daromą įtaką vaistinių melisų ištraukų kokybei; 5. Įvertinti vaistinių melisų tinktūrų antimikrobinį aktyvumą prieš etalonines mikroorganizmų kultūras.

11 1. LITERATŪROS APŽVALGA 1.1. Vaistinių melisų (lot. Melissa officinalis) bendra charakteristika Vaistinė melisa (lot. Melissa officinalis L.) tai daugiametis žolinis augalas, užaugantis iki 120 cm aukščio [20,42]. Augalas šakotas, apaugęs liaukiniais ir paprastais plaukeliais. Stiebas keturbriaunis, status. Lapai kiaušiniški, karbuoti arba karbuotai dantyti, kotuoti, priešiniai. Viršutinė lapų pusė plaukuota, o apatinė plaukuota tik prie gyslų [9,42]. Žiedai baltos arba rožinės spalvos, išsidėstę viršutinių lapų pažastyse [9,34,41,42]. Lotyniškas melisų pavadinimas kilęs iš graikiško žodžio,,melitos" - tai reiškia medų nešančią bitę [22,34]. Šeima: Notreliniai (Lūpažiedžiai) Lamiaceae (Labiateae) [7,9,11,14,17,28,33-35,42]. VAŽ visa antžeminė dalis: stiebai, lapai, žiedai [6,10,35,42]. Gali būti renkama melisų žolė arba lapai [9]. Žolė renkama 15-30 cm ilgio, prieš pat žydėjimą. Džiovinama gerai vėsinamoje patalpoje ar džiovykloje ne aukštesnėje nei 40 0 C temperatūroje. Gerai išdžiovinta žolė - tai 15-30 cm ilgio stiebų viršūnės su lapais, žalios spalvos, kartoko skonio, citrinų kvapo [9,33,34]. Paplitimas. Vaistinės melisos labai paplitusios Pietų ir Pietryčių Europoje, Azijoje bei Afrikoje [7,9,14,17,22,30,33-35,40,42]. 1.2. Vaistinių melisų žaliavos cheminė sudėtis 1. 0.06 0.8 proc. eterio aliejaus (40 proc. monoterpenai ir 35 proc. seskviterpenai: citralis, citronelalis, linalolis, geraniolis, nerolis ir kt.) [5,9,13,14,16,17,26,32,34,36,33,40]; 2. Fenoliniai junginiai (rozmarininės rūgšties (RA) 6 proc., p-kumaro bei kofeino rūgštys) [9,11,16-18,22,24,27,31,33,35-37,39]; 3. Askorbo rūgštis [5,9,10,27,34,42]; 4. Vitaminas B (tiaminas, riboflavinas) [5,27,34,42]; 5. Karotinas [27,34,42]; 6. Apie 5 proc. rauginių medžiagų [9,27,42]; 7. Taninai [17,26,39];

12 8. Flavonoidai (ramnazinas, kvercetinas, kemferolis) [9,10,16,17,26,27,32,34,39,42]; 9. Triterpeninės rūgštys [9,10,16,18,27,34,39,42]. Svarbiausių struktūrinių elementų formulės pateiktos 1 lentelėje [31,37,42]. 1 lentelė. Vaistinių melisų struktūrinių elementų formulės Cheminio junginio pavadinimas Cheminio junginio formulė Rozmarino rūgštis (RA) Citralis (izomerų neralio ir geranialio mišinys) ir Citronelalis Linalolis Nerolis Geraniolis 1.2.1. Polifenoliniai junginiai augalinėje žaliavoje Polifenoliniai junginiai antriniai augalų metabolitai, kurie nustatomi beveik visuose aukštesniuosiuose augaluose [2,20,29]. Dažniausiai jie aptinkami augaliniame maiste, pvz. vaisiuose, daržovėse, grūduose) ir augalinės kilmės skysčiuose vyne, kavoje bei arbatoje [20]. Jų reikšmė augalams iki galo neištirta. Manoma, kad polifenoliniai junginiai atlieka biocheminių procesų moduliatorių funkcijas, dalyvauja ekranuojant UV spinduliavimą bei augalui prisitaikant prie nepalankių aplinkos sąlygų. Jie apsaugo augalų ląsteles nuo oksidacinio bei deguonies trūkumo sukelto streso, sujungdami susiformavusius laisvuosius radikalus, dėl savo antimikrobinių savybių saugo augalą nuo patogeninių mikroorganizmų [2,20,29]. Dalis polifenolinių junginių yra spalvoti, jie suteikia atspalvius ir spalvas įvairioms augalų dalims:

13 lapams, žiedams, stiebams, vaisiams, todėl atlieka svarbų vaidmenį priviliojant vabzdžius, apdulkinančius augalus [2]. Dažniausiai aptinkami polifenoliniai junginiai yra fenolinės rūgštys, flavonoidai bei taninai [29]. Fenoliniai junginiai sudaro junginių klasę, kurios pagrinde yra fenolis C 6 H 5 OH. Polfifenoliai - tai fenoliniai junginiai, kurių aromatinis žiedas turi daugiau nei vieną hidroksigrupę. Farah A., Donangelo C. M. (2006) autorių duomenimis, fenoliniai junginiai, atsižvelgiant į jų struktūrą, gali būti skirstomi į skirtingas klases ir poklasius (2 lentelė). 2 lentelė. Fenolinių junginių pagrindinės klasės ir poklasiai (Farah A., Donangelo C. M) Klasės ir poklasiai Specifinių junginių pavyzdžiai Neflavonoidų junginiai Fenolinės rūgštys Benzoinės rūgštys Galo r., protokatechetinė r., p-hidrobenzoinė r. Hidroksicinamoninės rūgštys Kumaro r., kofeino r., ferulinė r. Hidrolizuojamieji taninai Pentagaloilgliukozė Stilbenai Resveratrolis Lignanai Matairezinolis, pinorezinolis, karikirezinolis ir kt. Flavonoidiniai junginiai Flavonoliai Kemferolis, kvercetinas, miricetinas Flavonai Apigeninas, liuteolinas Flavononai Naringeninas, hesperetinas Flavanoliai Katechinai, galokatechinai Antocianidinai Pelargonidinas, cianidinas, malvidinas Kondensuoti taninai ar proantocianidinai Trimeriniai proantocianidinai, prodelfinidinai Izoflavonai Genisteinas, gliciteinas, daidzeinas Šiuo metu polifenoliniai junginiai yra dažnas mokslinių tyrimų objektas dėl plataus jų pritaikymo medicinos praktikoje. Polifenoliniai junginiai dėl fenolinio žiedo hidroksilinės grupės gali prijungti laisvus elektronus ir funkcionuoti kaip efektyvūs antioksidantai [29]. Tai yra bene svarbiausia ir labiausiai analizuojama šių junginių savybė. Yra duomenų, jog daugelio polifenolinių junginių antioksidacinis aktyvumas yra daug didesnis nei gerai žinomų antioksidantų: askorbo rūgšties ar vitamino E [2,29]. Be antioksidantinio aktyvumo, polifenoliainiai junginiai gali veikti kaip uždegimą slopinantys agentai. Šie junginiai uždegimą slopina mažindami jį sukeliančių fermentų

14 (ciklooksigenazės (COX) ir lipoksigenazės (LOX)) bei mediatorių (leukotrienų (Lt) ir prostaglandinių (Pg)) aktyvumą [2]. Dėl minėtų antioksidantinio ir uždegimą slopinančių poveikių, polifenoliai turi teigiamą poveikį širdies ir kraujagyslių sistemai [2,20,29]. Taip pat, mokslinėje literatūroje yra aprašytas polifenolių priešvėžinis aktyvumas [2,20,29]. Yra manoma, kad šie junginiai slopina vėžinių ląstelių augimą bei jų transformaciją, navikų augimą, vėžinių ląstelių proliferaciją, angiogenezę, skatina vėžinių ląstelių apoptozę. Taip pat jie inhibuoja tirozinui specifinius fermentus: baltymų kinazes, topoizomerazę I ir topoizomerazę II. Dėl to vėžinių ląstelių augimas ir dalijimasis sulėtėja. Tačiau ne visi polifenoliniai junginiai turi vienodą poveikį vėžinėms ląstelėms. Nustatyta, kad stipriausiu antivėžiniu veikimu pasižymi kvercetino grupės flavonoliai. Be minėtų poveikių, mokslinėje literatūroje yra aprašomas ir antimikrobinis polifenolinių junginių veikimas. Tyrimų rezultatai parodė, jog šie junginiai bakterijų nesunaikina jų poveikis labiau bakteriostatinis [2]. Suminis polifenolinių junginių kiekio nustatymas dabartinėse studijose dažniausiai atliekamas spektrofotometriniu metodu [30]. Taip pat gali būti taikomas kolorimetrinis metodas arba efektyvioji skysčių chromatografija (ESC) [29]. 1.3. Vaistinių melisų biologinis poveikis ir pritaikymas medicinos praktikoje Vaistinių melisų sudėtyje yra daug veikliųjų junginių, kurie nulemia labai platų biologinį poveikį bei pritaikymą medicinoje. Labiausiai žinoma ir paplitusi vaistinių melisų indikacija yra nerimas bei nemiga, todėl vaistinės melisos dažnai būna raminamųjų arbatų ar kitų augalinių preparatų sudedamoji dalis [4,5,7,9,10,14,16-18,26,30,34,35,37,38,42]. Buvo atlikti tyrimai su žiurkėmis, kurių metu nustatyta, kad melisų vandeninė ar metanolinė ištrauka smegenyse esančią GABA transaminazę (GABA-T) veikia kaip inhibitorius nerimo, epilepsijos ir kitų neurologinių ligų terapijoje [10,18,38,39]. Identifikavus ir išskyrus veikliuosius junginius, nustatyta, kad didžiausią įtaką terapinio poveikio pasireiškimui turi RA bei triterpenininiai junginiai [18]. Fitocheminės analizės metu nustatyta, kad iš jų lyderiaujantį vaidmenį atlieka RA [10]. Kadangi vaistinės melisos vaikia raminančiai, jas vartojant patartina vengti alkoholio bei kitų raminamuoju poveikiu pasižyminčių vaistinių preparatų, pvz. lorazepamas, zolpidemas ir kt. [39]. Vaistinės melisos pasižymi bakteriostatiniu, antimikrobiniu bei antivirusiniu poveikiu [5,26,30,33]. Šiuo metu labai plačiai atliekami tyrimai, kuriuose bandoma įrodyti melisų poveikį prieš Herpes simplex virusą arba tiesiog pūslelinę [9,10,11,21,27,31,34,36,42]. Alan R. Gaby (2006) atliko atsitiktinį, dvigubai aklą tyrimą, kuriame dalyvavo 116 žmonių su pasikartojančiu (apie 4 kartus per pastaruosius metus) Herpes simplex virusu. Dalis jų buvo gydoma standartizuotu melisų ekstrakto

15 kremu, kita dalis - placebu. Gydymas buvo pradėtas per 72 val. nuo simptomų pasireiškimo ir tęsiamas nuo 5 iki 10 dienų, tepant pažeistą vietą 2-4 kartus per dieną. Gydymas buvo įvertintas "labai gerai" 41 pacientui, gydomam melisų ekstrakto kremu ir tik 19 pacientų, gydomiem placebu (p=0.022). Kadangi vaistinės melisos pasižymi antivirusiniu poveikiu, kai kurie autoriai teigia, jog jos gali būti vartojamos užsikrėtus ŽIV-1. Vaistinių melisų preparatai inhibuoja ŽIV-1 atvirkštinę transkriptazę tyrimuose in vitro [40]. Yra atlikti moksliniai tyrimai, kurie įrodo, jog vaistinės melisos, dėl jų sudėtyje esančios RA, stabdo vėžinių ląstelių dalijimąsi [9]. Boehm K. et al. (2012) atliko tyrimą in vitro, kuriame analizavo aromaterapijos svarbą. Vienas iš tyrimų objektų - vaistinės melisos. Šių autorių teigimu, melisų priešvėžinis aktyvumas pasireiškia dėl eterinių aliejų. Gauti rezultatai parodė, jog melisų aliejus buvo labai efektyvus prieš vėžines ląsteles, todėl padaryta išvada, jog jis gali būti potenciali priemonė gydant vėžį. Šis poveikis aiškinamas tuo, jog vaistinės melisos veikia kaip antioksidantai. Tokį poveikį yra aprašę ir kiti autoriai, tačiau jų teigimu, melisos efektyvumą naviko gydyme lemia ne eteriniai aliejai, o RA [9,16,17,19,24,26-28,31,33,34,36,37]. Mokslinėje literatūroje yra duomenų, jog vaistinės melisos pasižymi antihistamininiu poveikiu, todėl gali būti naudojamos išoriškai, dedant susmulkintą žolę ant vabzdžių įkandimo ar kitų sudirgintų vietų [9,14,33,37]. Melisos pasižymi kraujagysles plečiančiu bei kraujospūdį mažinančiu poveikiu, todėl gali būti vartojamos esant švelniai hipertenzijos formai ar kaip profilaktikos priemonė [9,30,37]. Yra duomenų, jog melisų preparatai padeda esant širdies skausmui, permušimams ar kitiems širdies veiklos sutrikimams [4,9,14,24,26-28,37]. Vaistinės melisos gali būti vartojamos kaip prieštraukulinė, nuskausminanti priemonė, kuri šalina stiprų galvos skausmą bei galvos svaigimą, mažina ūžimą ausyse [9,14,24,34]. Daugelio autorių teigimu, melisos turėtų būti rekomenduojamos pacientams, sergantiems epilepsija ar migrena [9,16,17,24,27,28,30,37]. Remiantis moksline literatūra, kai kurių autorių teigimu, vaistinės melisos skatina prakaitavimą, todėl gali būti vartojamos karščiuojant. Kadangi veikia priešuždegimiškai, padeda esant reumatiniams ir neuralginiams skausmams [5,9,14,17,26,31,34,36,37,39]. Amina Bounihi et al. (2013) atliko tyrimą su žiurkėmis, kuriame naudojo vaistinių melisų eterinį aliejų 200 mg/kg bei 400 mg/kg doze ir indometaciną įprasta 10 mg/kg doze. Gauti rezultatai parodė, jog po 6 val. melisų eterinis aliejus pasižymėjo didesniu priešuždegiminiu poveikiu nei indometacinas. Uždegimo slopinimas buvo išreikštas procentais, o rezultatai - atitinkamai 61.76 proc., 70.58 proc. ir 52.94 proc. Maike Petersen, Monique S. J. autorių teigimu, melisų priešuždegiminis poveikis yra pagrįstas LOX ir COX slopinimu. Remiantis moksline literatūra, vaistinėmis melisomis gali būti gydomas kosulys, bronchitas bei astma [9,10,30,42].

16 Atliekama daug tyrimų, norint įrodyti vaistinių melisų poveikį Alzheimerio ligos gydyme [7,9,10,14,26-28,34]. S. Akhondzadeh, M. Noroozian et al. (2003) autorių teigimu, toks poveikis egzistuoja dėl to, kad vaistinės melisos pasižymi acetilcholino (Ach) receptorių aktyvumu centrinėje nervų sistemoje (CNS). Nors daugelis autorių teigia, jog vaistinės melisos nesukelia šalutinių reakcijų, šių autorių tyrimo metu buvo pastebėta, kad vaistinės melisos vis dėlto gali sukelti mieguistumą ar sumišimą, taip pat pykinimą, vėmimą, viduriavimą, galvos skausmą, svaigimą bei dusulį. EMEA duomenimis, norint įrodyti vaistinių melisų poveikį gydant Alzheimerio ligą, buvo atliktas dvigubai aklas, placebu kontroliuojamas atsitiktinis tyrimas su vaistinių melisų eteriniu alieju bei donepezilu vienu iš pagrindinių cheminių vaistų, vartojamų Alzheimerio ligos gydyme. Eterinis aliejus buvo vartojamas išoriškai, dedant kompresus ant rankų. Tyrimų rezultatai parodė, jog melisų aromaterapija sukėlė pastebimą virpėjimo sumažėjimą lyginant su donepezilu ar placebu [39]. Analizuojant mokslinę literatūrą, randama duomenų, jog vaistinės melisos gali būti vartojamos esant virškinimo sutrikimams: gerina apetitą, skatina tulžies išsiskyrimą, slopina pykinimą bei vėmimą, mažina pilvo pūtimą [5,9,10,16,17,24,26,28,30,33,38,42]. EMEA duomenimis, vaistinių melisų sudėtyje esantys eteriniai aliejai tyrimuose in vivo, naudojant izoliuotas Gvinėjos kiaulių klubines bei triušių dvylikapirštes žarnas, pasižymėjo stipriu spazmolitiniu poveikiu [39]. Vaistinių melisų ištraukos yra rekomenduojamos pacientams, sergantiems cukriniu diabetu (CD), kadangi nustatyta, kad jos mažina gliukozės kiekį kraujyje. Poveikis gydant CD galimai pasireiškia dėl melisų sudėtyje esančio riboflavino, kuris veikia angliavandenių, riebalų bei baltymų apykaitą [5,26]. EMEA duomenimis, hipoglikeminis vaistinių melisų poveikis pasireiškia dėl jų sudėtyje esančio eterinio aliejaus. 2 tipo CD užkrėstos pelės buvo gydomos 6 savaites po 0.0015 mg/d eterinio aliejaus iš vaistinių melisų. Rezultatai parodė reikšmingą gliukozės kiekio kraujyje sumažėjimą, taip pat padidėjusią toleranciją gliukozei bei reikšmingą insulino kiekio serume padidėjimą lyginant su kontroline grupe. Yra tyrimų, įrodančių vaistinių melisų antilipideminį poveikį [39]. EMEA duomenimis, duodant vandeninio vaistinių melisų ekstrakto hiperlipideminėms žiurkėms 28 dienas po 2 g/kg buvo sumažintas bendras cholesterolio bei lipidų kiekis kraujyje [39]. Kai kurių autorių teigimu, melisų preparatai padeda esant skydliaukės hiperfunkcijai, inhibuodami tiroidus stimuliuojančio hormono (TSH) aktyvumą. Taip pat gali būti vartojami sergant Greivs'o liga [15,17,39,40]. Melisų preparatai padeda esant dismenorėjai bei amenorėjai, jais gali būti gydoma mažakraujystė [9,10,28].

1.4. Vaistinių melisų preparatai, esantys Lietuvos rinkoje 17 Šiuo metu Lietuvos rinkoje su vaistinių melisų žaliava yra šios vaistinės formos: 1. Arbata. Bendrais atvejais rekomenduojama 1.5 4.5 g trintų lapų per dieną [39,41,42]. Melisų arbatos galima įsigyti ir grynos, ir mišiniuose su kitomis vaistažolėmis, pvz. arbata "Melisų žolė" bei sudėtinė arbata, pvz. "Neuro-3", kurios sudėtyje kartu su melisomis yra ir valerijonų šaknų, apynių spurgų bei pipirmėčių lapų [45]. Yra atlikti tyrimai, kuriuose nustatytas arbatos dozavimas konkrečiais atvejais, pvz. esant miego sutrikimams suaugusiems pacientams reikia išgerti 80-150 mg vandeniu užplikytų melisų lapų kartu su 160-320 mg valerijonų šaknų 3 kartus per dieną. Gydymo kursas - 1 mėnuo. Dozuojant 1-2 kartus per dieną mažiausiomis dozėmis miegas pagerėja ir vaikams [23]. 2. Kapsulės. Tradicinis vaistinių melisų kapsulių dozavimas, jei nenurodyta kitaip, yra 300-500 mg, 3 kartus per dieną [39,41]. Kapsuliuotoje vaisto formoje, kaip ir arbatoje, vaistinės melisos gali būti vienos arba kartu su kitais vaistiniais augalais, pvz.,,persen forte", kuriame yra 17.5 mg melisų sausojo ekstrakto, ar net mikroelementais (pvz. magniu) -,,Magnis 24", kuriame yra 100 mg melisų [45]. 3. Ekstraktai - vaistinių melisų ekstraktai yra naudojami gaminant kapsuliuotas ar tabletuotas vaistinių melisų formas, tačiau galima rasti ir skysto ekstrakto pavidalu. Melisų sausasis ekstraktas randamas prieš tai minėtame preparate,,persen forte". Didesnės koncentracijos melisų ekstrakto randame,,vital nature top sleep herbal su melisų ekstraktu" preparate, kuriame vaistinių melisų yra 200mg, o rekomenduojama paros dozė - 1-2 tabletės per dieną [45]. Vartojant melisų ekstraktus skysta forma, jei nenurodyta kitaip, rekomenduojama paros dozė yra 2-4 ml tris kartus per dieną [39,41,42]. Ši dozuotė įrodyta moksliniais tyrimais, gydant Alzheimerio ligą. Tyrimuose naudota 60 lašelių standartizuoto melisų ekstrakto per dieną, paruošto naudojant 45 proc. etanolį, santykiu 1:1. Gydymas buvo tęsiamas 4 mėnesius, po kurių melisų ekstraktu gydomiems pacientams reikšmingai pagerėjo pažintinės funkcijos lyginant su placebo grupe [7,39]. Šiuo metu rinkoje galime rasti melisų ekstraktą, pagamintą santykiu 1:1, ekstrahentu naudojant 70 proc. etanolį. 4. Tinktūros - jei nenurodyta kitaip, rekomenduojama paros dozė yra 2-6 ml tris kartus per dieną [39,41,42]. Rinkoje egzistuoja melisų tinktūra, pagaminta santykiu 1:10, ekstrahentu naudojant 70 proc. etanolį. 5. Tabletės - melisų preparatų galima įsigyti ir tablečių forma, pvz.,,melissa dream", kurių 1 tabletėje yra 300 mg vaistinių melisų ekstrakto, santykiu 1:1. Tablečių sudėtyje taip pat yra B grupės vitaminų, magnio, vaistinių ramunių ekstrakto, bei L-teanino, išskirto iš žaliosios arbatos ekstrakto. Rekomenduojama paros dozė - 2 tabletės [45].

18 6. Aliejus. Melisų aliejus yra vartojamas išoriškai, dažniausiai įvairioms vonioms ar kompresams. Tokių aliejų dozavimas būna nuo 2 iki 5 lašų [42]. 7. Kremas - dažniausiai naudojamas 3 kartus per dieną, norint nuraminti paraudusią ar sudirgusią odą. Naudojant melisų kremą užsikrėtus Herpes labialis virusu, patariama jo tepti 2-4 kartus per dieną, tęsiant gydymą iki 14 dienų [41,42]. 8. Sirupai. Melisų sirupas, kaip ir daugelis kitų sirupų dažniausiai skiriamas vaikams. Šiuo metu rinkoje galima rasti,,melisovit" sirupą, kurio dozuotė priklauso nuo vaiko amžiaus ir įprastai skiriama nuo 5 iki 10 ml 3 kartus per dieną [45]. 1.5. Užpilai, nuovirai, tinktūros ir ekstraktai. Jų technologija bei analizės metodai Galima išskirti šias augalinės kilmės skystų vaisto formų kategorijas [6,12,25]: 1. Užpilai; 2. Nuovirai; 3. Tinktūros; 4. Ekstraktai. Vaistažolių arbatos (lot. Plantae ad ptisanam) - tai viena ar kelios vaistinės augalinės žaliavos, skirtos ruošti vandeninius preparatus - nuovirus (lot. Infusum), užpilus (lot. Decoctumu) ar maceratus. Ruošiamos prieš vartojimą. Vaistažolių arbatos, pagal Ph. Eu. (1997, 5.1.4-4 kategorija) gali būti ruošiamos naudojant verdantį ar neverdantį vandenį [6]. Gaminant augalines ištraukas karštuoju būdu, svarbi kaitinimo ir aušinimo trukmė. Užpilai kaitinami 15 min., aušinami - 45 min., nuovirai kaitinami 30 min., aušinami 10 min [12,43,44]. Tinktūros (lot. Tincturae) - tai skysti preparatai, paprastai gaunami iš džiovintų (sausų) augalinės ar gyvulinės kilmės žaliavų [6,12,25]. Kai kurių preparatų gamybai naudojama medžiaga turi būti iš anksto apdorojama, pvz. inaktyvuojami fermentai, susmulkinama arba nuriebinama. Tinktūros yra ruošiamos maceravimo, perkoliavimo ar kitu tinkamu įteisintu būdu, naudojant tam tikros koncentracijos etanolį. Tinktūros taip pat gali būti gaunamos ištirpinant arba praskiedžiant ekstraktus tam tikros koncentracijos etanoliu [6,12]. Tinktūrų gamybai dažniausiai taikomas maceracijos metodas. Maceracija tai procesas, kurio metu paruošta žaliava yra patalpinama į atitinkamą indą ir užpilama pasirinktu tirpikliu. Indas uždengiamas ir paliekamas nuo 3 iki 14 dienų vėsioje vietoje, periodiškai pamaišant, kol ištirpsta visos pasirinktame tirpiklyje tirpios medžiagos. Vėliau gauta tinktūra filtruojama, o likučiai ant filtro praplaunami nedideliu kiekiu pasirinkto tirpiklio [12].

19 Tinktūros paprastai gaunamos naudojant 1 dalį augalinės žaliavos ir 10 ekstrakcinio tirpiklio arba 1 dalį augalinės žaliavos ir 5 dalis ekstrakcinio tirpiklio [6,12]. Pagamintos tinktūros būna skaidrios, tačiau laikymo metu gali susidaryti nedidelis kiekis nuosėdų, nepakeičiančių tinktūrų sudėties [6]. Ekstraktai (lot. Extracta) - tai kietos, skystos ar tirštos (tarpinės) konsistencijos preparatai, dažniausiai gaunami iš išdžiovintos (sausos) augalinės medžiagos [5,6]. Pagal tai, kiek skystos fazės yra pašalinama iš augalinės ištraukos ekstrakto gamybos metu, ekstraktai skirstomi į skystuosius (lot. Extracta fluida), tirštuosius (lot. Extracta spisa) ir sausuosius (lot. Extracta sicca) [5,12]. Taip pat ekstraktus galima klasifikuoti pagal panaudotą ekstrahentą: vandeniniai, etanoliniai, eteriniai ar aliejiniai ekstraktai [5]. Skystieji ekstraktai yra skysti preparatai, kurių viena masės ar tūrio dalis yra ekvivalentiška vienai sausos (išdžiovintos) žaliavos daliai. Jeigu reikia, šių preparatų sudėtis tikslinama, kad atitiktų tirpiklio kiekio, sudedamųjų dalių ar sausų liekanų reikalavimus. Skystieji ekstraktai gali būti gaminami maceracijos, perkoliacijos bei reperkoliacijos metodais [25]. Dažniausiai taikomas perkoliacijos metodas [12]. Perkoliacija tai procesas, kurio metu žaliava yra užpilama nedideliu kiekiu pasirinkto tirpiklio iki vienodo sudrėkinimo. Taip paruošta žaliava paliekama 15 min., po to perkeliama į perkoliatorių. Tada žaliava prisotinama likusiu tirpikliu. Kada tirpiklis pradeda lašėti pro perkoliatorių, jis yra uždaromas. Žaliava paliekama maceruotis 24 valandoms arba ilgesniam laikui. Gautas ekstraktas yra renkamas, pridedant reikiamą kiekį tirpiklio taip, kad ekstrahuojama žaliava visada būtų prisotinta ekstrahentu. Jei surinkto ekstrakto nepakanka, perkoliatas toliau yra plaunamas pasirinktu tirpikliu ir surinkta ekstrakto porcija yra sumaišoma su prieš tai gauto ekstrakto dalimi [12]. Dar vienas skystų ekstraktų gamybos metodas yra ištirpinti tirštą ar sausą ekstraktą reikiamame tirpiklyje, ir jei reikia, perfiltruoti. Ekstraktui pastovėjus, leidžiamas nedidelis nuosėdų kiekis, jeigu po to jo sudėtis labai nepasikeičia [6]. Skystieji ekstraktai gali turėti reikalingų antimikrobinių konservantų [6]. Ir tinktūros, ir ekstraktai yra vertinami pagal vienodus kriterijus. Ph. Eu. nurodyti šie kokybės tyrimai: 1. Santykinis tankis (Ph. Eur. 1997, 2.2.5). Pagal šį rodiklį tinktūros/skystieji ekstraktai turi atitikti monografijoje nurodytas normas. 2. Etanolio kiekis (Ph. Eur. 1997, 2.9.10). Etanoliniams skystiems ekstraktams/tinktūroms nustatomas etanolio kiekis turi atitikti nurodytą. 3. Metanolis ir 2-propanolis (Ph. Eur. 1997, 2.9.11). Etanoliniuose skystuose ekstraktuose/tinktūrose turi būti ne daugiau kaip 0.05 proc. (V/V) metanolio ir 0.05 proc. (V/V) 2- propanolio, jeigu nenurodyta kitaip.

20 4. Sausos liekanos. Konkrečiu taikytinu atveju tinktūra/skystasis ekstraktas turi atitikti monografijoje nurodytas normas. Rezultatai pateikiami masės procentais arba gramais/litre. Laikymas. Laikoma sandariai uždarytame inde nuo šviesos apsaugotoje vietoje. Analizės metodai. Ekstraktų bei tinktūrų analizei gali būti naudojami įvairūs fito-cheminiai analizės metodai, pvz. efektyvioji skysčių chromatografija (ESC), spektrofotometrija, masių spektroskopija (MS) ir kt. Eksperimentinių tyrimų metu planuojama tirti melisų etanolines ir vandenines ištraukas, vertinant sauso likučio kiekį gravimetriniu metodu bei suminį polifenolinių junginių kiekį pagal KRE spektrofotometriniu metodu. 1.6. Ekstrahentų, naudojamų augalinių ištraukų gamyboje, charakteristikos Tik vartojant tinkamą ekstrahentą galima pagaminti kokybišką vaistą. Ekstrahentas parenkamas atsižvelgiant į šias savybes [1]: 1. Yra atrankus (selektyvus), t.y. tirpina tik tas medžiagas, kurias reikia ekstrahuoti, ir netirpina kitų, nereikalingų; 2. Chemiškai indiferentiškas ekstrahuojamoms medžiagoms; 3. Stabdo mikrofloros veikimą ekstrakte; 4. Farmakologiškai indiferentiškas; 5. Lakus, išgarinus nepalieka kvapo; 6. Nedegus, nesudaro su oru sprogstamųjų medžiagų; 7. Pigus. Vanduo - jis pasižymi daugeliu anksčiau išvardintų savybių ir dažniausiai vartojamas vienas ar mišiniuose su organiniais tirpikliais (pvz. etanoliu). Yra kelių švarumo kategorijų vanduo: išgrynintasis ir distiliuotas, nemineralizuotas ir geriamasis. Pastarasis turi atitikti higienos normas [1]. Modeliuojant farmacines vaistų formas (išskyrus injekcines), naudojamas išgrynintas arba distiliuotas vanduo. Jis turi atitikti Ph. Eu. 2000:0008 nurodytus reikalavimus [6]. Yra nustatyta, jog išgrynintojo vandens sausos liekanos negali viršyti 0.001 proc. (1 mg priemaišų 100 ml vandens). Pagrindiniai metodai, gaminant išgrynintą vandenį yra distiliacija, jonų mainų ar atvirkštinės osmosės [12,25]. Visgi, vandeniniai ekstraktai lieka nepatvarūs laikymo metu. Juose atsiranda mikroorganizmų, todėl jie greitai sugenda [1]. Tačiau vanduo vis tiek išlieka dažniausiai naudojamu tirpikliu pasaulyje [12,25]. Alkoholiai ekstrahavimui dažniausiai naudojamas etanolis, po jo metanolis, propanoliai ir butilo alkoholiai. Etanolis yra antras pagal populiarumą tirpiklis po vandens ir dažniausiai

21 pasirenkamas modeliuojant farmacinius preparatus, vartojamus per os [12,25]. Etanolis turi atitikti Ph. Eu. 01/2002:1317 straipsnio reikalavimus [6]. Nors šis ekstrahentas turi daug neigiamų savybių (farmakologinis neindiferentiškumas, žema užsiliepsnojimo temperatūra ir kt.), tačiau jas kompensuoja ir dažną jo pasirinkimą nulemia atrankumas ir atsparumas mikroorganizmams [1,25]. Platų etanolio pritaikymą taip pat lemia jo gebėjimas maišytis su vandeniu bei ištirpinti daugelį vandenyje netirpių medžiagų [25]. Šalia minėtų etanolio neigiamų savybių, jo pritaikymas yra ribojamas dėl galimo toksinio poveikio modeliuojant vaistų formas, skirtas vaikams. Maisto ir vaistų administracija įvertino ir nustatė rekomenduotinas etanolio koncentracijas įvairių amžių vaikams: iki 6 metų 0.5 proc., 6-12 metų 5 proc., 12 metų 10 proc. [25]. Visgi, plačiausiai farmacijoje, kaip ekstrahentas, naudojami etanolio-vandens mišiniai [4,25]. Taigi, eksperimentinių tyrimų metu, kaip ekstrahentus vaistinių melisų ištraukų gamyboje, planuojama naudoti vandenį bei etanolį.

Tinktūrų technologijos schema 22 2. TYRIMO METODIKA IR METODAI 2.1. Tyrimuose naudotos medžiagos 1) Vaistinių melisų išdžiovinti lapai (UAB,,Acorus calamus", 50 g, Lietuva); 2) 96 proc. etilo alkoholis (UAB,,Stumbras", Lietuva); 3) Distiliuotas vanduo; 4) Na 2 CO 3 (Merck KGaA, Vokietija); 5) Folin-Ciocalteu s reagentas (Folin-Ciocalteu s phenol reagent) (Sigma-Aldrich Laborchemikalien GmbH, Vokietija). 2.2. Vaistinių melisų (lot. Melissa officinalis) tinktūrų technologija Melisų tinktūros buvo gaminamos klasikinės maceracijos metodu, kai žaliavos ir ekstrahento santykis 1:5. Technologinės maceracijos metodo stadijos pateiktos 3 lentelėje [1]: 3 lentelė. Technologinės maceracijos metodo stadijos 1. Žaliavos į maceratorių dėjimas, ekstrahento pripylimas 2. Maceravimas (5-7 paras) 3. Ištraukos nupylimas ir slėgimas 4. Kartotinis ekstrahento pripylimas ir slėgimas 5. Sujungtų ištraukų nusistovėjimas (5-7 paras) 6. Dekantavimas ir filtravimas 7. Analizė ir standartizavimas Ekstrahento gamyba Eksperimentiniams tyrimams buvo naudojamas 96 proc. koncentracijos etanolis, iš kurio pagaminta po 100 ml 40 proc., 50 proc., 60 proc. ir 70 proc. koncentracijos etanolio. Etanolis turi

23 atitikti Ph. Eu. 01/2002:1317 straipsnio reikalavimus [5]. Reikalingas 96 proc. koncentracijos etanolio kiekis apskaičiuotas, naudojantis proporcija: 96 t. d. 100 t. d. A t. d. x t. d. 96 proc. etanolio x = 100*A /96; kur: A norima etanolio koncentracija; x reikalingas 96 proc. etanolio kiekis. Vandens kiekis kiekvienai etanolio koncentracijai yra lygus 100 ml x ml 96 proc. etanolio arba tiksliau - vandens iki 100 ml. Melisų tinktūrų technologija klasikinės maceracijos metodu Tinktūros gaminamos maceracijos metodu, santykiu 1:5 [5]. Gaminama 25 ml melisų tinktūros. Tinktūroms gaminti imama 5 g išdžiovintos melisų žaliavos, kuri susmulkinama iki reikiamo dydžio dalelių. Žaliava užpilama 40 ml 40 proc., 50 proc., 60 proc. ir 70 proc. etanoliu, kurio kiekis apskaičiuojamas atsižvelgiant į sugerties koeficientą: c = V + a*k; kur a žaliavos kiekis (g); V norimas pagaminti tinktūros kiekis (ml); c bendras etanolio kiekis (ml); k minkštųjų augalo dalių sugerties koeficientas (šiuo atveju - 3). Ekstrahavimosi metu pagamintos tinktūros buvo laikomos uždarame inde, tamsioje, vėsioje vietoje septynias dienas, kartas nuo karto pamaišant. Filtravimas Po septynių dienų tinktūros filtruojamos per filtravimo popierių. Iš viso pagamintos 4 tinktūros po 25 ml, naudojant 40 proc., 50 proc., 60 proc. ir 70 proc. koncentracijos etanolį.

Ekstraktų technologijos schema 2.3. Vaistinių melisų (lot. Melissa officinalis) ekstraktų technologija 24 Vaistinių melisų skystieji ekstraktai buvo gaminami klasikinės maceracijos bei perkoliacijos metodais, kai žaliavos ir ekstrahento santykis 1:1. Ekstraktų technologijos schema pateikta 4 lentelėje [1]. 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 4 lentelė. Ekstraktų technologijos schema Ektrahento gamyba Žaliavos brinkinimas Perkoliavimas Koncentravimas Koncentrato filtravimas Ženklinimas Kokybės kontrolė Ekstrahento gamyba Technologijai buvo naudotas 96 proc. koncentracijos etanolis, iš kurio pagaminta po 100 ml 40 proc., 50 proc., 60 proc. ir 70 proc. koncentracijos etanolio. Etanolis turi atitikti Ph. Eu. 01/2002:1317 straipsnio reikalavimus [5]. Reikalingas 96 proc. koncentracijos etanolio kiekis apskaičiuotas pagal proporciją: 96 t. d. 100 t. d. A t. d. x t. d. 96 proc. etanolio x = 100*A /96; kur: A norima etanolio koncentracija; x reikalingas 96 proc. etanolio kiekis. Vandens kiekis kiekvienai etanolio koncentracijai yra lygus 100 ml x ml 96 proc. etanolio arba tiksliau - vandens iki 100 ml. Melisų ekstraktų technologija klasikinės maceracijos metodu Gaminama 25 ml vaistinių melisų ekstrakto, santykiu 1:1. Vaistinių melisų žaliavos imama 25 g. Reikalingo etanolio kiekio skaičiavimai bei ekstraktų technologija klasikinės maceracijos metodu aprašyta 2.2 poskyryje.

25 Melisų ekstraktų technologija perkoliacijos metodu Melisų ekstraktai perkoliacijos metodu buvo gaminami pagal Ph. Eu. nurodytą metodiką [5]. Gaminama 25 ml ekstrakto, santykiu 1:1. Ekstrahuojama medžiaga susmulkinama iki reikiamo dydžio dalelių, tada sumaišoma su nedideliu kiekiu technologijai pasirinkto ekstrahento (etanolio) ir paliekama kurį laiką pastovėti (apie 15 min). Po to perkeliama į perkoliatorių ir leidžiama lėtai filtruotis užtikrinant, kad ekstrahuojama medžiaga visą laiką būtų padengta tirpikliu. Kada tirpiklis pradeda lašėti pro perkoliatorių, jis yra uždaromas. Žaliava paliekama maceruotis 7 dienom. Po 7 dienų gautas ekstraktas yra surenkamas, pridedant reikiamą kiekį tirpiklio taip, kad ekstrahuojama žaliava visada būtų prisotinta ekstrahentu [12]. Iš viso pagaminti 4 ekstraktai po 25 ml, naudojant 40 proc., 50 proc., 60 proc., 70 proc. koncentracijos etanolį, taikant klasikinės maceracijos metodą bei 4 ekstraktai po 25 ml, naudojant 40 proc., 50 proc., 60 proc., 70 proc. koncentracijos etanolį, taikant perkoliacijos metodą. 2.4. Vaistinių melisų (lot. Melissa officinalis) etanolinių ištraukų gamyba ekstrahuojant ultragarsu Eksperimentinis tyrimas atliekamas tam, kad būtų galima įvertinti, kaip fizikinis faktorius (ultragarsas) įtakoja vaistinių medžiagų išsiskyrimą iš melisų žaliavos. Šiuo metodu gaminamos melisų tinktūros (1:5) bei melisų ekstraktai (1:1). Žaliavos imama tiek pat, kiek gaminant anksčiau aprašytus - tinktūras bei ekstraktus - maceracijos ar perkoliacijos metodais. Žaliava stikliniuose cilindruose užpilama keturiomis skirtingomis etanolio koncentracijomis (40 proc., 50 proc., 60 proc., 70 proc.), tada uždedama speciali plėvelė, apsauganti tinktūras bei ekstraktus nuo išgaravimo. Taip paruošta žaliava dedama į ultragarsinę vonelę (Bandelin Sonorex Digitec ultragarso vonelė (DT 156, Bandelin electronic GmbH & Co. KG, Berlynas, Vokietija)), 20, 30 ir 40 min, esant 55 0 C temperatūrai. Gauti ekstraktai ir tinktūros filtruojami ir paliekami tolimesnei analizei. 2.5. Vaistinių melisų (lot. Melissa officinalis) arbatos technologija Gaminama 20 ml melisų arbatos, santykiu 1:5. Technologijai pasirinktas klasikinės maceracijos metodas. Nudojama išdžiovinta, kokybiška, susmulkinta melisų lapų žaliava, kurios

26 imama 4 g, o ekstrahento (vandens) - 32 ml (vandens kiekis apskaičiuotas pagal žaliavos sugerties koeficientą). Melisų žaliava apipilama verdančiu vandeniu ir uždengus laikoma apie 15-20 min. Tada filtruojama pro filtravimo popierių [6]. 2.6. Vaistinių melisų (lot. Melissa officinalis) etanolinių ir vandeninių ištraukų analizės metodai 2.6.1. Sauso likučio kiekio nustatymas Tinktūrose, ekstraktuose bei vandeninėse ištraukose esantis veikliųjų junginių sausasis likutis matuotas drėgnomačiu (MLS 50-3HA160). Imta 3 kartus po 2 ml kiekvienos etanolinės ir vandeninės ištraukos. Kaitinama 105 0 C temperatūroje 30 min [Ph. Eur. 2.8.16]. Iš gautų rezultatų vedamas aritmetinis vidurkis. 2.6.2. Suminio polifenolinių junginių kiekio nustatymas pagal p-kumaro rūgšties ekvivalentą spektrofotometriniu metodu Suminis polifenolinių junginių kiekis pagal p-kumaro rūgšties ekvivalentą (KRE) ekstraktuose ir tinktūrose bei vandeninėje ištraukoje buvo nustatomas spektrofotometriniu metodu, atliekant reakciją pagal Folin-Ciocalteu's metodą. Šį metodą suminiam polifenolinių junginių kiekio nustatymui yra aprašę ir kiti autoriai [39,43]. Tyrimui buvo naudojamas Agilent 8453 UV-Vis spektrofotometrą (,,Agilent Technologies, Inc." Santa Clara, JAV). 25 µl tiriamojo tirpalo matavimo kolbutėje buvo sumaišomi su 3 ml išgrynintojo vandens ir 1 ml Folin-Ciocalteu's fenolinio reagento. Po to buvo pridedama 1.5 ml 20 proc. Na 2 CO 3 tirpalo. Mišinys buvo skiedžiamas išgrynintuoju vandeniu iki 25 ml žymos. Tirpalai buvo laikomi 30 min. kambario temperatūroje. Absorbcija matuojama prie 765 nm bangos ilgio. Suminis polifenolinių junginių kiekis buvo išreikštas miligramais mililitre ekstrakto pagal KRE. Kiekvienas tyrimas su visomis pagamintomis etanolinėmis ir vandeninėmis ištraukomis kartojamas tris kartus. Iš gautų rezultatų vedamas aritmetinis vidurkis.

27 2.6.3. Vaistinių melisų (lot. Melissa officinalis) tinktūrų antimikrobinio aktyvumo vertinimas Antimikrobinio aktyvumo nustatymas atliekamas pagal Ph. Eu. 01/2002, 2.6.12. straipsnį. Tyrimas atliktas aseptinėmis sąlygomis. Mikrobiologinio tyrimo metu nustatyta tirto preparato MSK (minimali slopinanti koncentracija) tai didžiausias galimas preparatų praskiedimas, t.y. mažiausia tiriamo preparato koncentracija, kuri dar slopina konkrečios etaloninės mikroorganizmų kultūros augimą. Paruošti pagrindiniai tirpalai buvo skiedžiami 10 ml Miulerio-Hintono agaru (Mueller- Hinton Agar, Becton, Dickinson and Company) ir gaunami darbiniai skiediniai Miulerio-Hintono agare, kuriuose nustatytas tiriamų preparatų slopinamasis poveikis (MSK) etaloninių mikroorganizmų augimui. Po to į kiekvieno skiedimo Petri lėkštelę su Miulerio-Hintono agaru buvo sėjamos etaloninės mikroorganizmų kultūros: Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Candida albicans, Bacila cereus, Pseudomonas aeruginosa, Klebsiella pneumoniae, Proteus mirabilis, Enterococcus faecalis, Staphylococcus epidermidis. Pasėliai buvo inkubuojami 24 val. termostate 37 o C temperatūroje. Tada išmatuotas mikroorganizmų augimas sėjimo zonoje [3].

28 3. REZULTATAI 3.1. Vaistinių melisų (lot. Melissa officinalis) tinktūrų kokybės vertinimas Kad įvertinti ekstrahento įtaką vaistinių medžiagų išsiskyrimui iš vaistinių melisų žaliavos pagamintų tinktūrų, kaip tirpikliu pasirinktas 40, 50, 60 ir 70 proc. etanolis. 3.1.1. Ekstrahento įtaka vaistinių melisų tinktūrų (1:5) kokybei Vaistinių melisų tinktūrų kokybė vertinta nustatant veikliųjų junginių kiekį. Svarbu įvertinti suminį polifenolinių junginių išsiskyrimą pagal 2.6.2 metodiką. Rezultatai pateikiami 5 lentelėje. 5 lentelė. Etanolio koncentracijos įtaka suminiam polifenolinių junginių kiekiui vaistinių melisų tinktūrose Etanolio koncentracija, % 40% 50% 60% 70% Suminis polifenolinių junginių 11.41 12.93 8.25 6.98 kiekis pagal KRE (mg/ml) ±0.87 ±0.76 ±0.32 ±0.36 Didžiausias polifenolinių junginių kiekis, tiriant vaistinių melisų tinktūras, nustatytas naudojant 50 proc. etanolį. Naudojant 40 proc. etanolį gautas suminis polifenolinių junginių kiekis buvo panašus, taigi statistiškai reikšmingas skirtumas tarp šių dviejų etanolio koncentracijų nebuvo nustatytas (1 lentelė). Naudojant 60 ir 70 proc. etanolį, išsiskyręs polifenolinių junginių kiekis buvo statistiškai reikšmingai mažesnis (5 lentelė). Taip pat nustatomas sausas likutis, pagal metodiką, pateiktą 2.6.1, kad būtų galima įvertinti išekstrahuojamas medžiagas. Rezultatai pateikiami 6 lentelėje.