Ekstrakcija biološko aktivnih spojin iz Ganoderme lucidum ob uporabi organskih topil in superkritičnih fluidov

Dejan Turk Ekstrakcija biološko aktivnih spojin iz Ganoderme lucidum ob uporabi organskih topil in superkritičnih fluidov Magistrsko delo Maribor, november, 2014

Ekstrakcija biološko aktivnih spojin in Ganoderme lucidum ob uporabi organskih topil in Magistrsko delo študijskega programa II. stopnje Študent: Študijski program: Predvideni strokovni naslov: Mentor: Komentor: Delovni mentor: Dejan Turk magistrski študijski program II. stopnje Kemijska tehnika magister inženir kemijske tehnike red. prof. dr. Željko Knez red. prof. dr. Mojca Škerget Darija Cör uni. dipl. inž. kem. teh. in dr. Tanja Botić Maribor, november, 2014

IZJAVA Izjavljam, da sem magistrsko delo izdelal sam, prispevki drugih so posebej označeni. Pregledal sem literaturo s področja magistrskega dela po naslednjih geslih: Vir: ScienceDirect Gesla: Ganoderma lucidum 2821 Ganoderma lucidum AND fatty acids 612 Ganoderma lucidum AND polysaccharides 1575 Ganoderma lucidum AND proteins 2007 Ganoderma lucidum AND triterpenes 361 Skupno število pregledanih člankov: 40 Skupno število pregledanih knjig: 2 Maribor, november, 2014 Dejan Turk podpis I

Zahvala Zahvaljujem se mentorju red. prof. dr. Željku Knezu za usmerjanje in vodenje pri izdelavi mojega magistrskega dela. Zahvaljujem se tudi komentorici red. prof. dr. Mojci Škerget. Izredna zahvala Dariji Cör uni. dipl. inž. kem. teh. in dr. Tanji Botić za vse nasvete in pomoč pri praktičnem delu. Posebna zahvala velja tudi moji družini, ki mi je stala ob strani, ko je bilo to najbolj potrebno. II

Ekstrakcija biološko aktivnih spojin iz Ganoderme lucidium ob uporabi organski topil in Povzetek Namen magistrskega dela je bil pridobiti in okarakterizirati ekstrakte iz trosnjakov in primodijev gobe Ganoderma lucidum. V ta namen smo izvedli klasično ekstrakcijo materiala z različnimi organskimi topili, pri dveh temperaturah (sobna, vroča). Sledila je kemijska karakterizacija ekstraktov, ki je obsegala določevanje vsebnosti skupnih fenolov, polisaharidov in proteinov. Določevanje biološke aktivnosti je obsegalo merjenje antioksidativne aktivnosti ekstraktov z DPPH metodo in sposobnost zaviranja encima acetilholinesteraze z Ellmanovo metodo. Rezultati so pokazali, da na izkoristke ekstrakcij vpliva polarnost topila. Izbira topila prav tako vpliva na vsebnosti skupnih fenolov, kjer smo pri ekstrakcijah z etanolom in acetonom zabeležili največje vsebnosti le teh. Polisaharide smo pridobivali po različnih v literaturi opisanih postopkih in ugotovili, da trosnjaki vsebujejo predvsem proste polisaharide, medtem ko primodiji vsebujejo veliko kompleksov fenol- polisaharid. V ekstraktu pridobljenem iz primodijev G. lucidum beležimo petkrat večje vsebnosti proteinov, kot v ekstraktu pridobljenim iz trosnjaka gobe. Največji odstotek zaviranja radikala DPPH smo izmerili po dodatku ekstrakta pridobljenega po vroči ekstrakciji z acetonom, tako pri trosnjakih kot pri primodijih. Antioksidativna aktivnost organskih ekstraktov sovpada z vsebnostjo skupnih fenolov. Ekstrakti bogati s polisaharidi pridobljeni iz trosnjakov so imeli večjo sposobnost zaviranja radikala DPPH v primerjavi z ekstrakti pridobljenih iz primodijev. Boljšo antioksidativno aktivnost je imel tudi ekstrakt bogat s proteini pridobljen iz trosnjakov v primerjavi z ekstraktom iz primodijev gobe. Pri testu zaviranja encima acetilholinesteraza smo ugotovili, da imajo ekstrakti bogati z polarnimi kot nepolarnimi spojinami iz primodijev in trosnjakov G. lucidum sposobnost zaviranja encima. Največjo sposobnost zaviranja acetilholinesteraze so pokazali ekstrakti pridobljeni s heksanom iz primodijev G. lucidum. Ključne besede: Ganoderma lucidum, trosnjaki, primodiji, klasična ekstrakcija, fenoli, polisaharidi, proteini, antioksidanti, zaviralci acetilholinesteraze. UDK: 54-139:544.032.732(043.2) III

Extraction of biologically active compound from Ganoderma lucidum using organic solvents and fluids Abstract The purpose of the master thesis was to obtain and characterize the extracts from the fruiting body and primodia of Ganoderma lucidum. For this purpose we carried out a classical extraction of material with various organic solvents at two temperatures (room temperature, hot). This was followed a chemical characterization of the extracts, which included the determination of the content of total phenolics, polysaccharides and proteins. Determination of biological activity consisted from measuring of the antioxidant activity of extracts with DPPH method and the ability of the enzyme acetylcholinesterase inhibition with Ellman s method. The results showed that on the efficiency of extraction affects the polarity of the solvent. The choice of solvent also affects on the content of total phenols, where we are in the extraction with ethanol and acetone recorded the highest levels of these. Polysaccharides were extracted by various methods described in the literature and found that fruiting bodies containing mostly free polysaccharides, while primodia contain a lot of complexes phenolpolysaccharide. The extract obtained from primodia of G. lucidum recorded five times higher protein content than the extract obtained from the fruiting bodies of mushrooms. The largest percentage of inhibition of radical DPPH was measured after addition of the extract obtained by hot extraction with acetone, both fruiting bodies such as the primodia. The antioxidant activity of the organic extracts coincides with the content of total phenols. Extracts rich in polysaccharides extracted from the fruiting body had a greater ability to inhibition of radical DPPH compared to extracts derived from primodia. Better antioxidant activity had also extract rich in proteins extracted from the fruiting body compared with an extract from primodia of mushrooms. The inhibition test of acetylcholinesterase showed, that extracts rich with polar and nonpolar compounds from the fruiting body and primodia of G. lucidum have the ability to inhibit the enzyme. Greater ability of acetylcholinesterase inhibition showed extracts obtained with hexane from primodia of G. lucidum Key words: Ganoderma lucidum, fruiting bodies, primodia, classical extraction, phenols, polysaccharides, proteins, antioxidants, inhibitors of the acetylcholinesterase UDK: 54-139:544.032.732(043.2) IV

Kazalo 1 Uvod... 1 2 Teoretični del... 2 2.1 Ganoderma lucidum... 2 2.1.1 Opis gobe... 2 2.1.2 Zdravilne lastnosti G. lucidum... 3 2.1.3 Gojenje... 3 2.1.4 Rastne faze... 4 2.2 Biološko aktivne spojine... 4 2.2.1 Fenolne spojine... 4 2.2.2 Triterpenoidi in derivati... 5 2.2.3 Polisaharidi... 6 2.2.4 Proteini... 7 2.2.5 Maščobne kisline... 7 2.3 Antioksidanti... 7 2.3.1 Antioksidativna aktivnost G. lucidum... 8 2.4 Encim acetilholinesteraza... 10 2.4.1 Zaviranje encima acetilholinesteraze z G. lucidum... 10 2.5 Ekstrakcija trdno- tekoče... 10 2.5.1 Dejavniki ki vplivajo na hitrost reakcije... 11 2.6 Konvencionalna topila... 12 2.6.1 Metanol... 13 2.6.2 Etanol... 13 2.6.3 Aceton... 14 2.6.4 Heksan... 14 2.6.5 Voda (H 2 O)... 15 2.7 Kemijske analize... 15 2.7.1 Določanje skupnih sladkorjev... 15 2.7.1.1 Metoda reakcije sladkorjev z aromatskimi fenoli... 15 2.7.2 Določanje skupnih fenolov... 15 2.7.2.1 Metoda za določanje vsebnosti skupnih fenolov... 15 2.7.3 Določanje skupnih proteinov... 16 2.7.3.1 Bradfordova metoda... 16 2.7.3.2 Biuretska metoda... 16 2.7.3.3 Loweryjeva metoda... 16 2.7.4 Tankoslojna kromatografija (TLC)... 16 2.8 Biološka aktivnost... 17 2.8.1 Določanje antioksidativne aktivnosti... 17 2.8.1.1 DPPH radikalska metoda... 17 2.8.1.2 Luminescenčne metode... 18 2.8.1.3 ABTS + radikalska metoda... 18 2.8.2 Določanje zaviranja encima acetilholinesteraze (AChE)... 19 2.8.2.1 Ellmanova metoda... 19 3 Eksperimentalni del... 20 3.1 Laboratorijski pribor, aparature in kemikalije... 20 3.2 Priprava osnovnega materiala... 20 3.3 Konvencionalna ekstrakcija z organskimi topili (hladna, vroča)... 20 3.3.1 Vroča ekstrakcija... 21 3.3.2 Hladna ekstrakcija... 21 3.3.3 Ekstrakcija fenolov, proteinov in polisaharidov... 22 V

3.4 Kemijska analiza ekstraktov... 23 3.4.1 Določanje vsebnosti totalnih fenolov... 23 3.4.2 Bradfordova metoda za določanje skupnih proteinov... 25 3.4.3 Določanje skupnega sladkorja v surovih polisaharidih... 26 3.5 Biološka aktivnost ekstraktov... 27 3.5.1 Določanje antioksidativne aktivnosti z radikalsko metodo... 27 3.5.2 Določanje inhibicije encima acetilholinesteraze... 28 4 Rezultati in diskusija... 29 4.1 Trosnjaki... 29 4.1.1 Sejalna analiza... 29 4.1.2 Konvencionalna ekstrakcija trosnjakov G. lucidum z organskimi topili... 31 4.1.3 Kemijske analize trosnjakov... 32 4.1.3.1 Določanje vsebnosti skupnih fenolov v organskih ekstraktih... 32 4.1.3.2 Določanje skupnega sladkorja v ekstraktih bogatih s polisaharidi... 33 4.1.3.3 Določanje vsebnosti skupnih fenolov v ekstraktih bogatih s polisaharidi 34 4.1.3.4 Določanje vsebnosti proteinov z Bradfordovo metodo... 34 4.1.3.5 Določanje vsebnosti skupnih fenolov v ekstraktih bogatih s proteini... 35 4.1.4 Biološke aktivnosti trosnjakov... 36 4.1.4.1 Določanje antioksidativne aktivnosti organskih ekstraktov z radikalsko metodo DPPH... 36 4.1.4.2 Določanje antioksidativne aktivnosti ekstraktov bogatih s polisaharidi z radikalsko metodo DPPH... 37 4.1.4.3 Določanje antioksidativne aktivnosti ekstraktov bogatih s proteini z radikalsko metodo DPPH... 38 4.1.4.4 Zaviranje acetilholinesteraze (AChE) z organskimi ekstrakti... 39 4.1.4.5 Zaviranje acetilholinesteraze (AChE) z ekstrakti bogatimi s polisaharidi 40 4.1.4.6 Zaviranje acetilholinesteraze (AChE) z ekstrakti bogatimi s proteini... 41 4.2 Primodiji... 42 4.2.1 Sejalna analiza... 42 4.2.2 Konvencionalna ekstrakcija primodijev G. lucidum z organskimi topili... 44 4.2.3 Kemijske analize primodijev... 45 4.2.3.1 Določanje vsebnosti skupnih fenolov v organskih ekstraktih... 45 4.2.3.2 Določanje skupnega sladkorja v ekstraktih bogatih s polisaharidi... 46 4.2.3.3 Določanje vsebnosti skupnih fenolov v ekstraktih bogatih s polisaharidi 47 4.2.3.4 Določanje vsebnosti proteinov z Bradfordovo metodo... 47 4.2.3.5 Določanje vsebnosti skupnih fenolov v ekstraktih bogatih s proteini... 48 4.2.4 Biološke aktivnosti primodijev... 49 4.2.4.1 Določanje antioksidativne aktivnosti organskih ekstraktov z radikalsko metodo DPPH... 49 4.2.4.2 Določanje antioksidativne aktivnosti ekstraktov bogatih s polisaharidi z radikalsko metodo DPPH... 50 4.2.4.3 Določanje antioksidativne aktivnosti ekstraktov bogatih s proteini z radikalsko metodo DPPH... 50 4.2.4.4 Zaviranje acetilholinesteraze (AChE) z organskimi ekstrakti... 51 4.2.4.5 Zaviranje acetilholinesteraze (AChE) z ekstrakti bogatimi s polisaharidi 52 4.2.4.6 Zaviranje acetilholinesteraze (AChE) z ekstrakti bogatimi s proteini... 53 4.3 Tankoslojna kromatografija... 53 VI

4.3.1 Določevanje tipa sladkorjev v ekstraktih bogatih s polisaharidi s tankoslojno kromatografijo (TLC)... 53 4.4 Primerjava rezultatov kemijske analize in bioloških aktivnosti ekstraktov pridobljenih iz trosnjakov in primodijev G. lucidium... 54 5 Zaključek... 58 6 Literatura... 60 7 Priloge... 64 7.1 Meritve in izračuni za dločanje vsebnosti totalnih fenolov... 64 7.2 Meritve in izračuni za določanje skupnega sladkorja v ekstraktih bogatih s polisaharidi 1.del... 65 7.3 Meritve in izračuni za določanje skupnega sladkorja v ekstraktih bogatih s polisaharidi 2.del... 65 7.4 Meritve in izračuni za določanje vsebnosti proteinov z Bradfordovo metodo... 66 7.5 Meritve in izračuni za določevanje antioksidativne aktivnosti organskih ekstraktov z radikalsko metodo DPPH... 67 7.6 Meritve in izračuni za zaviranje acetilholinesteraze (AChE) z organskimi ekstrakti 68 VII

Seznam tabel Tabela 2-1: Rezultati raziskav za ekstrakte pridobljene iz G. lucidium... 9 Tabela 4-1: Meritve in izračuni sejalne analize zmletih trosnjakov... 29 Tabela 4-2: Rezultati sejalne analize za trosnjake... 31 Tabela 4-3: Izkoristek vroče (v) in hladne (h) ekstrakcije (η v %) trosnjakov (T) ob uporabi različnih organskih topil: metanol (MeOH), etanol (EtOH), aceton (AcOH) in heksan (Hex).... 31 Tabela 4-4: Meritve in izračuni pri sejalni analizi zmletih primodijev... 42 Tabela 4-5: Rezultati sejalne analize za primodije... 44 Tabela 4-6: Izkoristek vroče (v) in hladne (h) ekstrakcije (η v %) primodijev (P) ob uporabi različnih organskih topil: metanol (MeOH), etanol (EtOH), aceton (AcOH) in heksan (Hex).... 44 Tabela 4-7: Rezultati kemijskih analiz in testiranih bioloških aktivnosti ekstraktov iz trosnjakov (T) G. lucidium.... 54 Tabela 4-8: Rezultati kemijskih analiz in testiranih bioloških aktivnosti ekstraktov iz primodijev (P) G. lucidum.... 55 VIII

Seznam slik Slika 2-1: Ganoderma lucidum [2]... 2 Slika 2-2: Strukturne raznolikosti različnih fenolnih spojin... 5 Slika 2-3: Diagram strukture β-d-glukanov [9]... 7 Slika 2-4: Shematski postopek ekstrakcije [28]... 11 Slika 2-5: Prikaz polarnosti najbolj uporabljenih topil za ekstrakcijo [31]... 13 Slika 2-6: Kromatografska plošča z nanešenim vzorcem [43]... 17 Slika 3-1: Konvencionalna ekstrakcija; vroča ekstrakcija- levo in hladna ekstrakcija- desno... 22 Slika 3-2: Poenostavljen shematski prikaz pridobivanja polisaharidov, proteinov in fenolov [11]... 23 Slika 3-3: Umeritvena krivulja z galno kislino... 24 Slika 3-4: Umeritvena krivulja za določanje totalnih beljakovin... 26 Slika 3-5: Umeritvena krivulja za določanje skupnega sladkorja v polisaharidih... 27 Slika 4-1: Krivulja integralne porazdelitve mas zmletih trosnjakov... 30 Slika 4-2: Krivulja diferencialne porazdelitve mas zmletih trosnjakov... 30 Slika 4-3: Vsebnost skupnih fenolov v gramu ekstrakta (mg GAg ekstrakta ± SD) pridobljenega z vročo (v) ali hladno (h) ekstrakcijo trosnjakov (T) ob uporabi različnih organskih topil (metanol (MeOH), etanol (EtOH), aceton (AcOH) in heksan (Hex)... 32 Slika 4-4: Vsebnost sladkorja (mg GLCg ekstrakta ± SD) v ekstraktih bogatih s polisaharidi pridobljenih po ekstrakciji trosnjakov (T) z različnimi postopki: T-čv čisti vodni; T-psc, ki smo ga pred obarjanjem z 20% trifloroocetno kislino kuhali v 2% NaOH, 3 ure in T-p- EtOH 3:1, kjer smo po kuhanju z 2% NaOH in obarjanju z 20% trifluoroocetno kislino raztopini dodali EtOH v razmerju 3:1... 33 Slika 4-5: Vsebnost skupnih fenolov v gramu ekstrakta bogatega z polisaharidi (mg GAg ekstrakta ± SD) po ekstrakciji trosnjakov (T) z različnimi postopki: T-čv čisti vodni; T-psc, ki smo ga pred obarjanjem z 20% trifloroocetno kislino kuhali v 2% NaOH, 3 ure in in T-p- EtOH 3:1, kjer smo po kuhanju z 2% NaOH in obarjanju z 20% trifluoroocetno kislino raztopini dodali EtOH v razmerju 3:1.... 34 Slika 4-6: Vsebnost skupnih proteinov za trosnjake mg BSAg ekstrakta ± SD... 35 Slika 4-7: Vsebnost skupnih fenolov v gramu ekstrakta bogatega z proteini (mg GAg ekstrakta ± SD)... 36 Slika 4-8: Odstotek zaviranja radikala DPPH (% ± SD) po dodatku ekstrakta pridobljenega po vroči (v) ali hladni (h) ekstrakciji trosnjakov (T) ob uporabi različnih organskih topil (metanol (MeOH), etanol (EtOH), aceton (AcOH) in heksan (Hex)... 37 Slika 4-9: Odstotek zaviranja radikala DPPH (% ± SD) po dodatku ekstrakta bogatega z polisaharidi pridobljenih po ekstrakciji trosnjakov (T) z različnimi postopki: T-čv čisti vodni; T-psc, ki smo ga pred obarjanjem z 20% trifloroocetno kislino kuhali v 2% NaOH, 3 ure; in T-p- EtOH 3:1, kjer smo po kuhanju z 2% NaOH in obarjanju z 20% trifluoroocetno kislino raztopini dodali EtOH v razmerju 3:1... 38 Slika 4-10: Odstotek zaviranja radikala DPPH (% ± SD) po dodatku ekstrakta bogatega z proteini... 39 IX

Slika 4-11: Odstotek zaviranja encima AChE (% ± SD) po dodatku ekstrakta pridobljenega po vroči (v) ali hladni (h) ekstrakciji trosnjakov (T) ob uporabi različnih organskih topil (metanol (MeOH), etanol (EtOH), aceton (AcOH) in heksan (Hex)... 40 Slika 4-12: Odstotek zaviranja encima AChE (% ± SD) po dodatku ekstrakta bogatega z polisaharidi pridobljenih po ekstrakciji trosnjakov (T) z različnimi postopki: T-čv čisti vodni; T-psc, ki smo ga pred obarjanjem z 20% trifloroocetno kislino kuhali v 2% NaOH, 3 ure in T-p- EtOH 3:1, kjer smo po kuhanju z 2% NaOH in obarjanju z 20% trifluoroocetno kislino raztopini dodali EtOH v razmerju 3:1.... 40 Slika 4-13: Odstotek zaviranja encima AChE (% ± SD) po dodatku ekstrakta bogatega z proteini... 41 Slika 4-14: Krivulja integralne porazdelitve mas zmletih primodijev... 43 Slika 4-15: Krivulja diferencialne porazdelitve mas zmletih primodijev... 43 Slika 4-16: Vsebnost skupnih fenolov v gramu ekstrakta (mg GAg ekstrakta ± SD) pridobljenega z vročo (v) ali hladno (h) ekstrakcijo primodijev (P) ob uporabi različnih organskih topil: metanol (MeOH), etanol (EtOH), aceton (AcOH) in heksan (Hex).... 45 Slika 4-17: Vsebnost sladkorja (mg GLCg ekstrakta ± SD) v ekstraktih bogatih s polisaharidi pridobljenih po ekstrakciji primodijev (P) z različnimi postopki: P-čv čisti vodni; P-psc, ki smo ga pred obarjanjem kuhali v 2% NaOH, 3 ure in P-p- EtOH 3:1, kjer smo po kuhanju z 2% NaOH in obarjanju z 20% trifluoroocetno kislino raztopini dodali EtOH v razmerju 3:1... 46 Slika 4-18: Vsebnost skupnih fenolov v gramu ekstrakta bogatega z polisaharidi (mg GAg ekstrakta ± SD) po ekstrakciji primodijev (P) z različnimi postopki: P-čv čisti vodni; P-psc, ki smo ga pred obarjanjem kuhali v 2% NaOH, 3 ure in P-p- EtOH 3:1, kjer smo po kuhanju z 2% NaOH in obarjanju z 20% trifluoroocetno kislino raztopini dodali EtOH v razmerju 3:1.... 47 Slika 4-19: Vsebnost skupnih proteinov za primodije mg BSAgekstrakta ± SD... 48 Slika 4-20: Vsebnost skupnih fenolov v gramu ekstrakta bogatega z proteini (mg GAg ekstrakta ± SD).... 48 Slika 4-21: Odstotek zaviranja radikala DPPH (% ± SD) po dodatku ekstrakta pridobljenega po vroči (v) ali hladni (h) ekstrakciji primodijev (P) ob uporabi različnih organskih topil: metanol (MeOH), etanol (EtOH), aceton (AcOH) in heksan (Hex).... 49 Slika 4-22: Odstotek zaviranja radikala DPPH (% ± SD) po dodatku ekstrakta bogatega z polisaharidi pridobljenih po ekstrakciji primodijev (P) z različnimi postopki: P-čv čisti vodni; P-psc, ki smo ga pred obarjanjem kuhali v 2% NaOH, 3 ure in P-p- EtOH 3:1, kjer smo po kuhanju z 2% NaOH in obarjanju z 20% trifluoroocetno kislino raztopini dodali EtOH v razmerju 3:1... 50 Slika 4-23: Odstotek zaviranja radikala DPPH (% ± SD) po dodatku ekstrakta bogatega z proteini... 51 Slika 4-24: Odstotek zaviranja encima AChE (% ± SD) po dodatku ekstrakta pridobljenega po vroči (v) ali hladni (h) ekstrakciji primodijev (P) ob uporabi različnih organskih topil: metanol (MeOH), etanol (EtOH), aceton (AcOH) in heksan (Hex).... 52 Slika 4-25: Odstotek zaviranja encima AChE (% ± SD) po dodatku ekstrakta bogatega z polisaharidi pridobljenih po ekstrakciji primodijev (P) z različnimi postopki: P-čv čisti vodni; P-psc, ki smo ga pred obarjanjem kuhali v 2% NaOH, 3 ure in P-p- EtOH 3:1, kjer smo smo po kuhanju z 2% NaOH in obarjanju z 20% trifluoroocetno kislino raztopini dodali EtOH v razmerju 3:1... 52 Slika 4-26: Odstotek zaviranja encima AChE (% ± SD) po dodatku ekstrakta bogatega z proteini... 53 X

Slika 4-27: Tankoslojna kromatografija sladkorjev v ekstraktih bogatih s polisaharidi pridobljenih iz trosnjakov in primodijev G. lucidium... 54 XI

Uporabljeni simboli in kratice η izkoristek (%) m ekstrakta masa zatehtane G. lucidium (g) m vijale + ekstrakta masa vijale in ekstrakta (g) m vijale masa vijale (g) Abs absorbanca (1) b odsek premice umiritvene krivulje galne kisline na osi absorbance a naklon premice umiritvene krivulje galne kisline (mlmg) 0 A c 15 A s absorbanca referenčne raztopine v času 0 min absorbanca raztopine vzorca v času 15 min Grški simboli γ GA koncentracija galne kisline v raztopini ekstrakta (mgml) Kratice BHA BHT PG TBHQ TNF IL SOD CAT GPx AChE ACh PSA TLC DPPH ABTS DNTB GA CBB SD 3-terciarni butil-4-hidroksi anizol 2,6- diterciarni butil-p-hidroksi toluen propil galat terciarni butilhidrokinon tumor nekroza faktorja interlevkini superoksid dismutaza karnitin-acilkamitin translokaza glutation peroksidaza acetilholinesteraza acetilholin fenol- žveplova (VI) kislina tankoslojna kromatografija 1,1- difenil-2- pikrilhidrazil 2,2-azobis-3-etilbenzotiazolin-6-sulfonska kislina 5,5- ditiobis- 2 nitrobenzojska kislina galna kislina Coomassie Brilliant Blue standardna deviacija XII

1 Uvod V svetu obstajata zahodna in kitajska medicina. Zahodna temelji na sintetičnih zdravilih in kirurgiji, medtem ko kitajska temelji na alternativnem pristopu h preventivi in zdravljenju. Slednji spada tudi uporaba gob iz rodu Ganoderma med njimi najbolj poznana Ganoderma lucidum s številnimi biološko aktivnimi komponentami. V širšem azijskem prostoru (Kitajska, Koreja, Malezija, Indonezija in Japonska), so zdravilne lastnosti gob poznane že več tisočletij. Predstavljajo del vsakdanjega življenja in zdravljenja različnih vrst bolezni. Steroli, steroidi, polisaharidi, terpeni, terpenoidi predstavljajo le nekaj učinkovin iz gob, ki jih v medsebojnih kombinacijah najdemo v tržno vse bolj popularnih, podpornih zdravilih brez recepta. Služijo kot podporna terapija po obsevanjih pri rakastih obolenjih, saj znatno dvignejo imunske sposobnosti organizma. V zgodovini uporabe farmacevtsko najbolj zanimivih gob in njihovih učinkovin vselej zasledimo tudi podatek, da so le te zelo dragocene. Veljale so kot denarna valuta in bile so namenjene najbolj premožnim ljudem. Zaradi izjemnih učinkov na zdravje spadajo gobe na Japonskem, Kitajskem in širšem daljnem vzhodu, med najbolj zanimive organizme pri sodobnem biotehnološkem razvoju finih bioproduktov. Glede na njihovo povpraševanje se tovrstne gobe gojijo in trenutno je v ospredju modernejši pristop gojenja t.i. submerzni postopek. Submerzni postopek gojenja farmacevtsko zanimivih gob omogoča biosintezo esencialnih učinkovin s protitumorskim, protivirusnim, protiholesterolnim in protitromboznim delovanjem, za zdravljenje rakastih obolenj, infekcij, diabetisa, povišanega pritiska, epilepsije in drugih bolezenskih stanj. Tržni produkti G. lucidum se uporabljajo v obliki sirupov, injekcij, tablet, kapsul, tinkture, ter čajev. Glavni cilj magistrske naloge je bil pridobiti ter kemijsko in biološko okarakterizirati ekstrakte iz gobe Ganoderma lucidum. V ta namen smo izvedli klasično ekstrakcijo materiala z različnimi organskimi topili, pri dveh temperaturah (sobna, vroča). Sledila je kemijska karakterizacija ekstraktov, ki je obsegala določevanje vsebnosti skupnih fenolov, polisaharidov in proteinov. Določevanje biološke aktivnosti je obsegalo določevanje antioksidativne aktivnosti ekstraktov z metodo DPPH in inhibicijo encima acetilholinesteraze z Ellmanovo metodo. 1

2 Teoretični del 2.1 Ganoderma lucidum 2.1.1 Opis gobe Goba Ganoderma lucidum (v nadaljevanju G. lucidum), prikazana na sliki 2-1 je lesna goba. Njen trosnjak je ledvičaste oblike. Zgrajen je iz dveh delov: beta in klobuka. Betovo meso je svetlo rjave barve, veliko 3 do 19 cm in debelo 0,5 do 4 cm. Bet je temno škrlatnordeče barve, njegova površina je sijoča. Klobuk je ob robu tanek in prisekan, pogosto je tudi rahlo zavihan navznoter. Ko je v zraku veliko vlage postane površina klobuka sijoča. Sij najdemo tudi na betu. Klobukovo meso je plutovinaste strukture in ima brazdasto površino, ki je pri mladih gobah rumena, s staranjem spremeni barvo od rdečerjave do temno škrlatnorjave, včasih že skoraj črne barve. Pore gobe so sprva bele, v zreli dobi rjave. Na 1 mm 2 klobukove trosovnice je 4 do 5 por. Spore se nahajajo na spodnji strani klobuka; ko dozorijo se razpršijo. So rdečkastorjave, elipsoidne oblike s topim koncem. Dolge so 8 do 11,5 µm in široke 5 do 7,5 µm. Stena spore je dvojna s številnimi oporniki. Micelij raste longitudialno- radialno, na začetku je bele barve in je hitrorastoč. V zreli rastni dobi se obarva rumeno do zlatorjavo in je gosto zaraščen. Pogosto se s starostjo tudi razdeli v predelke. Nekateri sevi tvorijo tudi rjavo obarvani himenofor. Značilen za bazidomicete je septirani micelij. Pri G. lucidum so hife večinoma neseptirane, vendar so možne tudi povezave med hifami. Hifin sistem je dimitičen. [1] Slika 2-1: Ganoderma lucidum [2] 2

2.1.2 Zdravilne lastnosti G. lucidum Slovenija je s svojim raznovrstnim okoljem dom več kot 2400 različnim vrstam gob, izmed katerih se mnogo makromicet globalno uporablja v obliki naravnih učinkovin. G. lucidum ali slovensko»svetlikava pološčenka«se, že tisočletja uporablja v različne zdravilne namene. Tradicionalno je povezana z dostojanstvom, zdravjem, okrevanjem, dolgo življenjsko dobo, spolno aktivnostjo, modrostjo in srečo. G. lucidum danes velja za gobo z mnogimi farmacevtsko zanimivimi unčinkovinami. Dokazano je, da vsebuje substance z analgetičnimi, hepato- zaščitnim, kardiotoničnimi, hipoholesterolskimi, hipoglikemiskimi, imunomodulatornimi, protitumorskimi in drugimi učinki. Zaradi olesenelega mesa G. lucidum ni primerna za uživanje vendar je njene zdravilne substance možno izolirati in jih uporabiti kot farmacevtike. Zaradi sinergističnih učinkov njenih substanc je gobo bolj smiselno uporabljati kot nutricevtik (delno prečiščeno) ali nutracevtik (neprečiščeno). [3] V zadnjih nekaj letih omenjena vrsta postaja vse bolj popularna v Sloveniji kot prehransko dopolnilo. Uporabniki G. lucidum kot prehranskega dopolnila poročajo o zmanjšanju stranskih učinkov kemoterapije, simptomov alergij in stresa, izboljšanju imunskega sistema pri virusnih in bakterijskih infekcijah. [4] Zdravilne učinke G. lucidum pripisujejo predvsem triterpenoidom in polisaharidom, poleg naštetih obstajajo tudi druge aktivne substance. Učinkovine se nahajajo v trosnjaku in podgobju. Plodišče G. lucidum vsebuje: ogljikove hidrate (reducirajoče sladkorje in polisaharide), aminokisline, proteine, polipeptide, vitamine, steroide, sterole, triterpenoide, lipide, alkaloide in furane. G. lucidum vsebuje tudi elemente, kot so Mg, Mn, Mo, Ca, Zn, K, Na, Fe, Cu, S in Ge. Poleg naštetega še ergosterol, glivni lizocim in kislo proteazo. Spore vsebujejo: holin, betain, stearinsko kislino, palmitinsko kislino, pentadokozanoično kislino, tetradokozanično kislino tetrakozan, ergosterol, itd. Micelij vsebuje sterole, laktone, alkaloide, polisaharide in triterpenoide. [3] Tržni produkti G. lucidum se uporabljajo v obliki sirupov, injekcij, tablet, kapsul, tinkture, pilul, čajev in v kombinaciji z medom, kavo in čokolado. Uporabljajo se za zdravljenje različnih bolezni: nevrastenije, prebavnih motenj, nespečnosti, kroničnega hepatitisa, vnetja ledvic, visokega nivoja serumskega holesterola, hipertenzije, levkocitopenije, rinitisa, kroničnega bronhitisa, angine, bronhialne astme, gastropatije, razjed na dvanajsterniku in drugih bolezenskih stanj. Aktivne substance G. lucidum, se uporabljajo tudi pri zdravljenju danes najbolj nevarnih bolezni kot so rak in virusa humane imunske pomanjkljivosti (HIV). Številni polisaharidi delujejo citotoksično in aktivirajo imunski sistem. [3] 2.1.3 Gojenje G. lucidum je v Sloveniji ogrožena in zavarovana vrsta, raste na drevesih listavcev (hrast, javor, brest, vrba), na lokacijah po celi Sloveniji. Te vrste so v preteklosti nabirali v naravi, danes jih lahko gojimo pod umetnimi pogoji, na različnih substratih, drevesnih deblih ali na žaganju v plastičnih vrečkah oz steklenicah. [4] 3

Razvit je tudi biotehnološki postopek gojenja G. lucidum v bioreaktorjih, tako na trdnem substratu kot tekočem mediju. Gojenje na drevesnih deblih ali žaganju je relativno preprosto, poceni, vendar dolgotrajno (nekaj mesecev) in daje manjši pridelek. Rastišče je potrebno stalno nadzorovati, skrbeti za stalne in ustrezne pogoje (temperatura, vlažnost, svetloba) in preprečevati mikrobiološko kontaminacijo. Gojenje v bioreaktorjih je mnogo zahtevnejše in dražje, v sterilnih pogojih, vendar daje večji pridelek, bolj enotno micelijsko biomaso, primerno za pridobivanje čistejših in kvalitetnejših ter s tem bolj varnih ekstraktov za medicinsko uporabo. [5] 2.1.4 Rastne faze Glavni del gobe je sestavljen iz finih niti (hife), ki skupaj tvorijo micelij. Večinoma časa je micelij skrit, saj raste skozi zemljo ali izpod podrtih dreves ali razpadajočih živalskih in rastlinskih ostankov. Hrano za rast dobi goba tako, da razgradi odmrle ostanke in potem izpusti preproste prehranske izdelke, ki se absorbirajo skozi hife, katere tvorijo micelij. Ko so pogoji ravno pravi (enkrat ali dvakrat letno, lahko tudi večkrat) zbrani micelij tvori trosnjake. Trosnjaki so lahko različnih oblik, barv in velikosti. [6] Spore gob so kot semena cvetoče rastline in so mikroskopsko majhne. Iz trosnjakov se sprostijo z vetrom, dežjem in včasih tudi s pomočjo živali. Ko spore pristanejo na primerni površini začnejo rasti (kaliti), dokler ne tvorijo finih hif, ki sčasoma oblikujejo micelij. Pod ugodnimi pogoji, se micelij razvije v trosnjake, ki tvorijo spore in tako se rastni cikel ponovi. [6] 2.2 Biološko aktivne spojine Trosnjaki, micelij in spore G. lucidum vsebujejo vsaj 400 različnih bioaktivnih snovi, ki v glavnem vključujejo fenolne spojine, triterpenoide, polisaharide, nukleotide, proteine in peptide. Poleg teh so biološko aktivnost izkazali tudi steroli, aminokisline in oleinska kislina. [37] 2.2.1 Fenolne spojine Gobe kopičijo različne fenolne spojine z imunomodulatornimi, kardiovaskularnimi, protidiabetičnimi, protivirusnimi in protitumorskimi lastnostmi. [7] Fenolne spojine so daleč najbolj bogat vir antioksidantov. Imajo močne antioksidativne lastnosti, ki jim omogočajo, da lovijo proste radikale, donirajo vodik, kelatne kovinske ione ter prekinejo verižne radikalne reakcije. [7] Strukturno fenolne spojine sestavljajo en ali več aromatskih obročev, na katere je vezana najmanj ena hidroksilna spojina in se pojavljajo kot preproste fenolne molekule do visoko polimerizirane spojine. Kljub strukturni raznolikosti se to skupino spojin pogosto imenuje polifenoli. [8] 4

Strukturne raznolikosti različnih fenolnih spojin, ki se pojavljajo v naravi, lahko razvrstimo v več razredov, kot je prikazano na sliki 2-2. Slika 2-2: Strukturne raznolikosti različnih fenolnih spojin Fenolne kisline lahko razdelimo v dve podskupini in sicer hidroksibenzojeve (galna, p- benzojeva, protokatehulna in sirinska kislina, ki imajo skupno strukturo C6-C1) in hidroksicimetne (aromatske spojine z tremi stranskimi verigami ogljika, C6-C3) kisline. Flavnoidi predstavljajo največjo skupino fenolov, in so nizkomolekularne spojine, sestavljene iz petnajstih ogljikovih atomov, ki so razporejeni v konfiguracijo C6-C3-C6. Tanini so visokomolekularne spojine, ki sestavljajo tretjo pomembno skupino fenolov in se lahko razdelijo na hidrolizirane in kondenzirane tanine. [10] 2.2.2 Triterpenoidi in derivati V plodišču in miceliju G. lucidum se nahaja več kot sto različnih vrst visoko oksidiranih triterpenoidov lanostaninskega tipa: ganoderične kisline, ganulocidne kisline, lucidenske kisline, ganoderiol tipa 1 in 2, ganoderal, epoksiganoderiol, lucidon, furanoganoderična kislina, itd. Triterpenoidi imajo pomembno vlogo pri zaščiti jeter. Šest triterpenoidov lanostanoidnega tipa je citotoksičnih za rakave jetrne celice. Najpomembnejši med njimi so ganoderična kislina R, ganoderična kislina S in ganoderični aldehid A, ki deluje citotoksično na jetrne celične linije PLCPRF5 in KB celice in vitro. [3] Oksidirani lanosterolni derivati, izolirani iz G. lucidum, delujejo kot uravnalni mehanizem holesterola v krvi. Med njimi sta najpomembnejši ganoderična kislina B in C. Omenjeni imata oksigenirani skupini na mestu 7 in 15, ki zavirata prenos elektronov do intermediata (-oksifero intermediat-) v sintezi holesterola. Mehanizem te regulacije je predvsem pomemben za zdravljenje arterioskleroze in drugih bolezni srca in ožilja. Ekstrakt plodišča 5

G. lucidum, bogat z triterpeni in steroli deluje na celice srčnega mišičja tako, da zniža hitrost bitja srca in poveča amplitudo bitja. Med izoliranimi substancami ima ganodermanontriol največji učinek na omenjena parametra. Procentualno povečanje amplitude bitja srca z ganodermanontriolom je enako povečanju z digoksinom. Amplitudo bitja srca povečata v manjši meri tudi ganoderična kislina S1 in portensterol. [3] Ganoderična kislina je tista, ki gobi daje grenak okus in ima številne terapevtske lastnosti. Njen prekurzor je lanosterol, ki ga redko najdemo v rastlinskem svetu, a v G. lucidum ta sodeluje pri razmnoževanju celic. Številne raziskave so pokazale, da ganoderične kisline izolirane iz trosnjaka in spor G. lucidum delujejo protivnetno, zavirajo HIV-1 proteazo, zavirajo hitamin in imajo protitumorni učinek. Ganoderična kislina C zavira biosintezo holesterola medtem, ko ganoderični kislini F in S ščitita pred aterosklerozo. [14] Triterpenoidi iz ekstrakta G. lucidum imajo različne učinke na kardiovaskularni sistem: na srce delujejo kardiotonično, bradikardno; delujejo hipotenzivno (-ganoderal A, ganoderola A in B, ganoderske kisline B, D, F, K, S in Y-) zaradi zaviranja simpatičnega živčevja; hipoglikemično (-ganoderan A, B, C-), ker znižajo koncentracijo krvnega sladkorja tako, da povišajo nivo inzulina v plazmi in povišajo metabolizem glukoze v perifernih tkivih in jetrih. [3] Poleg naštetih učinkov so triterpenoidi citotoksični za tumorske celice, delujejo protivirusno, znižujejo nivo lipidov, aktivirajo imunski sistem ter lajšajo bolečine. Preprečujejo tudi lepljenje trombocitov. [3] 2.2.3 Polisaharidi Polisaharidi so med najpomembnejšimi substancami izoliranimi iz G. lucidum. Zanimivi so za farmacevtsko industrijo zaradi številnih zdravilnih učinkov. Najpomembnejši sta protitumorska in imunostimulativna, poleg tega delujejo tudi hipoglikemično, protiangiogeno, preprečujejo alergične reakcije, zaščitijo pred sevanjem in ščitijo jetra. Polisaharidi iz plodišča G. lucidum spadajo v skupino β- D- glukanov, katerih struktura je prikazana na sliki 2-2. Njihova osnovna veriga je sestavljena iz (1-3) D-glukoznih ostankov, na njej se občasno pojavljajo tudi razvejitve. Tu so z β- ( 1-6 ) vezjo vezane posamezne D- glukozilne enote na kisikov atom glukana ali so vezane kratke verige glukozilnih enot na atom kisika. Poleg β-d-glukanov se v plodišču glive nahajajo tudi vodotopni heteropolisaharidi, ki vsebujejo D- glukozo, D- galaktozo, D-manozo, L ali D- arabinozo, D- ksilozo in L- fruktozo. Protitumorsko aktivnost pa imajo tudi α- manani. [3] 6

Slika 2-3: Diagram strukture β-d-glukanov [9] 2.2.4 Proteini Gobe producirajo številne proteine in peptide, kot so to lektini, ribonukleaze in laktaze z imunomodulatornim, protibakterijskim in protiglivičnim delovanjem. [13] Iz G. lucidum so izolirali protein Ling Zhi-8, ki ga sestavlja 110 aminokislin in mu pripisujejo imunomodulatorno delovanje. Molekulska masa polipeptidne verige Ling Zhi-8 je 13-17 kda z nizko vsebnostjo ogljikovih hidratov. [5,14, 15] 2.2.5 Maščobne kisline Maščobne kisline preko receptorjev vplivajo na številne celične funkcije. Rezultati raziskav so pokazali, da ergosteroli in njegovi analogi G. lucidum delujejo protivirusno, zavirajo proces staranja kože, ter ščitijo možgansko skorjo nevronov pri hipoksiji. Dolgoverižne maščobne kisline izolirane iz spor G. lucidum delujejo protitumorsko tako, da sprožijo celično smrt. [16] 2.3 Antioksidanti Antioksidanti na različne načine upočasnijo ali celo popolnoma ustavijo oksidacijo molekul, ki jih povzroči vezava prostih radikalov. Zaradi te lastnosti antioksidante poznamo tudi kot t.i. lovilce prostih radikalov. Kopičenje prostih radikalov v telesu pospešuje procese staranja, slabijo imunski sistem, zmanjšujejo telesne funkcije in vplivajo na živčni sistem. To lahko vodi do razvoja rakastih obolenj, bolezni srca in ožilja, ateroskleroze in drugih bolezenskih stanj. [17] Prosti radikali v telesu nastajajo kot posledica okoljskih vplivov, (onesnažen zrak, ionizirajoče sevanje in UV svetloba), vnosa škodljivih snovi (konzervansov, pesticidov, 7

drugih kemikalij, katrana, alkohola), stresa, ipd. Prosti radikali nastajajo kot stranski produkt celičnega dihanja, kar pomeni, da so tudi del normalnih fizioloških procesov. [17] Prosti radikali so zelo reaktivni in nestabilni ter nenadzorovano in hitro reagirajo z drugimi molekulami v našem telesu. Gre za molekule, ki imajo v svoji zgradbi primanjkljaj elektrona. Takšne molekule skušajo zapolniti to prosto mesto in s tem ponovno vzpostaviti ravnovesje v svoji zgradbi, zaradi česar zelo intenzivno in hitro reagirajo z drugimi bolj ali manj reaktivnimi atomi, ioni ali molekulami. V telesu so najpogostejši kisikovi prosti radikali, ki kvarijo telesu lastne beljakovine in maščobe, v hujših primerih celo dedni material. [17] S tem, ko se antioksidanti vežejo na proste kisikove radikale preprečijo, da bi se ti vezali z telesu lastnimi molekulami, ter njihovo oksidacijo. Najpomembnejši antioksidanti so: vitamin C in E, provitamin A (β- karoten), minerali (selen in cink ) ter fenolne spojine (flavonoidi, izoflavoni, koencim Q10 in ubikvinon) Antioksidanti so za zaščito celičnih molekul ključnega pomena. [17] Glede na delovanje jih delimo na: Encimske (superoksid dismutaza, katalaza, glutation peroksidaza, glutation reduktaza), ki se v glavnem nahajajo znotrajcelično; Neencimske (vitamin C, glutation, vitamin E, koencim Q10, β- karoten), ki delujejo znotraj- in zunaj- celično, saj gre za majhne molekule. Antioksidanti so lahko sintetičnega ali naravnega izvora: Sintetični antioksidanti so BHA (3-terciarni butil-4-hidroksi anizol), BHT (2,6- diterciarni butil-p-hidroksi toluen), PG (propil galat) in TBHQ (2- terciarni butilhidrokinon); Naravni antioksidanti so askorbinska in citronska kislina ter njune soli, tokoferoli in fenolne spojine, katerih vir so živila. [18] 2.3.1 Antioksidativna aktivnost G. lucidum Med različnimi naravnimi viri antioksidantov imajo gobe pomembno vlogo. Ekstrakti pripravljeni iz micelija in trosnjakov gob kažejo antioksidativne lastnosti. Antioksidativna aktivnost je povezana z vsebnostjo polisaharidov, fenolov in proteinov. [19] Antioksidativno aktivnost polisaharidom prepisujejo zaradi njihove sposobnosti lovljenja prostih radikalov, sposobnost keliranja Fe 2+ ionov, hemolizi eritrocitov in povečanju aktivnosti encimov, ki sodelujejo pri antioksidativnih procesih. [20] Ekstrakti gob bogati s polisaharidi z antioksidativnim delovanjem, so najpogosteje pridobljeni s postopki, ki vključujejo vodo inali alkohole kot ekstrakcijska topila. Koncentracija polisaharidov je odvisna od stopnje razvoja trosnjakov, pogojev in časa 8

shranjevanja, ter dodatnega čiščenja samih ekstraktov. Skupna vsebnost glukanov se spreminja na celotno vsebnost polisaharidov glede na uporabljen postopek ekstrakcije. Ekstrakti polisaharidov vsebujejo glukozo, kot prevladujočo monosaharidno komponento in v večji ali manjši meri še drug monosaharid. [20] Sposobnost cepitve prostih radikalov je odvisna od velikosti ogljikovih hidratov; polisaharidi imajo večjo zmožnost nevtraliziranja prostih radikalov, kot monosaharidi, vendar je antioksidativna aktivnost še vedno nizka. Polielektroliti, kot so sulfatni ali fosfolirani glukani, lipopolisaharidi imajo bistveno močnejšo sposobnost lovljenja prostih radikalov. Sposobnost lovljenja prostih radikalov je odvisna od prisotnosti vodika, ter določenih monosaharidnih enot. [20] Aktivne substance stimulirajo nespecifično in specifično imunsko odpornost in imajo zaviralni učinek pri odstranjenih tumorjih. Pri stimulaciji delujejo na makrofage, ki povečajo proizvodnjo tumor nekroza faktorja (TNF α) in interlevkinov (IL). Poleg tega, pospešujejo sintezo DNK vraničnih celic v kulturi mešanih limfocitov in stimulirajo sintezo RNK in DNK v mišjem kostnem mozgu. Dokazano je tudi da polisaharidi učinkujejo proti sarkomu. [3] V tabeli 2-1 so predstavljeni nekateri rezultati raziskav antioksidativnih lastnosti ekstraktov pridobljenih iz G. lucidum. Tabela 2-1: Rezultati raziskav za ekstrakte pridobljene iz G. lucidium Ekstrakti bogati z: Rezultati raziskav polisaharidi polisaharidi G. lucidum so znatno okrepili delovanje antioksidantnih encimov ( SOD, CAT in GPx ) in zmanšali raven IL-1b, IL-6 in TNF-α pri podganah z rakom materičnega vratu. oralno aplicirani polisaharidi G. lucidum imajo protihiperglikemične učinke in lahko učinkovito normalizirajo oksidativni stres v plazmi in jetrih podgan z diabetesom. triterpeni polifenoli proteini [21,22,23,24,25] triterpeni so pri švicarskih albino miših povečali aktivnost nekaterih antioksidativnih encimov v krvi so se izkazali kot učinkovito kemopreventivno sredstvo pri raku dojke. pri ribah z okužbo z virusom živčne nekroze so z dodajanjem proteina h hrani dokazali 6 do11 kratno povečanje genske ekspresije TNF-α in IL-1β ter fagocitno aktivnost. Rezultati kažejo, da protein deluje protivirusno ter imunostimulatorno. 9

2.4 Encim acetilholinesteraza Acetilholinesteraza (AChE) je glavni encim pri hidrolizi acetilholina (ACh) v možganih. Analize aktivnosti AChE lahko služijo za postavljanje diagnoze po potencialni izpostavljenosti organofosfornim in karbamatnim pestecidom, lahko se uporabljajo tudi za preverjanje učinkovitosti zdravljenja nerodegenerativnih boleznih, npr. Alzheimerjeve bolezni. [26] AChE je prisotna v holinergičnih sinapsah, kjer na postsinaptični membrani razgradi nevrotransmiter acetilholin in s tem prekine prenos živčnega signala med celicama. Odsotnost ali pretirano zmanjšanje aktivnosti acetilholina povzroči nevrološke težave pri Alzheimerjevi bolezni. Osnovno vodilo pri iskanju učinkovin za zdravljenje napredovanja Alzheimerjeve bolezni je ojačanje holinergičnega sistema tako, da se poveča količina acetilholina. Najenostavnejša pot za dosego tega cilja je zaviranje AChE, ki razgrajuje acetilholin s sintezami ali naravnimi zaviralci. [27] 2.4.1 Zaviranje encima acetilholinesteraze z G. lucidum Z laboratorijskimi testi so Hasant in sod. (2013) dokazali zaviranje acetilholinesteraze in antioksidativne aktivnosti ekstrakta G. lucidum, ki so jo gojili na kaljivem rjavem rižu. Rezultati te študije so pokazali, da so ekstrakti gobe znatno povečali aktivnost antioksidativnih encimov (SOD, CAT in GPX) v jetrih in možganih poskusnih miši. [7] Vodni ekstrakti G. lucidum so pokazali tudi sposobnost zaviranja AChE. Takrin (pozitivna kontrola) je pokazala bistveno nižjo zaviralno aktivnost od ekstrakta pridobljenega iz G. lucidum. Sposobnost zaviranja AChE avtorji povezujejo z visoko vsebnostjo fenolnih in flavnoidnih spojin v ekstraktu. Med njimi sta bila kvercetin in ursolna kislina kot glavni sestavini ekstraktov G. lucidum. Za ti spojini je znano, da imata še številne druge biokemične aktivnosti, ter ščitijo pred razvojem nevrodegenerativnih bolezni. [7] 2.5 Ekstrakcija trdno- tekoče Ekstrakcija je postopek s katerim odstranjujemo iz trdnih ali tekočih zmesi topne komponente s topilom. Ekstrakcija sestoji iz dveh zaporednih operacij. V prvi spravimo zmes v intenziven stik s topilom, v drugi obe faze ločimo. Proces ekstrakcije trdnih snovi z regeneracijo in recikliranjem topila poenostavljeno prikazuje slika 2-4. Postopek uporabljamo predvsem za pridobivanje olj iz plodov semen ter za pridobivanje arom, začimb in farmacevtskih substanc iz rastlin in sadežev. Kot topilo uporabljamo hlapna organska topila, v določenih primerih tudi vodo. V splošnem lahko proces razdelimo v tri stopnje: 1. fazna sprememba pri raztapljanju topljenca, 2. difuzija topljenca v topilu, ki se nahaja v porah trdnega materiala na površino delca, 10

3. prenos topljenca skozi tekočinski film na površini delca v glavni tok topila. [29] Slika 2-4: Shematski postopek ekstrakcije [28] Katerikoli izmed teh stopenj lahko omejuje ekstrakcijsko hitrost, običajno pa prvi proces poteče tako hitro, da je njegov vpliv na ekstrakcijsko hitrost zanemarljiv. [29] 2.5.1 Dejavniki ki vplivajo na hitrost reakcije Pri ekstrakcijskem procesu moramo upoštevati naslednje štiri dejavnike, ki vplivajo na potek ekstrakcije: Velikost delcev vpliva na hitrost ekstrakcije na več načinov. Čim manjša je velikost delcev, tem večja je medfazna površina med trdnim materialom in tekočino, zato je prenos snovi hitrejši. Tako je tudi difuzijska pot topljenca iz notranjosti delca manjša. Zelo fini delci lahko ovirajo separacijo delcev in fluida in se lahko sprimejo v večje delce in tako ovirajo pretok fluida. V splošnem naj bi se izogibali zelo 11

majhnim delcem, želeno pa je, da je območje velikosti porazdelitve delcev čim manjše, saj tako vsak delec zahteva približno enak čas za ekstrakcijo. Topilo. Izbira topila je zelo pomembna. Izbrati moramo selektivno topilo z nizko viskoznostjo. Med ekstrakcijo koncentracija topljenca v topilu narašča, ekstrakcijska hitrost pa pada zaradi zmanjšanja koncentracijskega gradienta in deloma tudi zaradi naraščanja viskoznosti raztopine. Temperatura. Topnost komponente v večini primerov narašča s temperaturo, zato narašča ekstrakcijska hitrost. Na ekstrakcijsko hitrost vpliva tudi difuzijski koeficient, ki narašča s temperaturo. Zgornja meja temperature je v nekaterih primerih določena sekundarno, npr. z aktivnostjo encima, ekonomičnostjo procesa, itd. Mešanje Topila. Mešanje je pomembno, saj poveča snovi prenos s površin materiala v glavno maso topila. Razen tega preprečuje sedimentacijo delcev. Granulacija materiala naj bi bila čim manjša, če hitrost procesa kontrolira difuzija topljenca skozi porozni material in zato je tudi difuzijska pot čim krajša. Če hitrost procesa kontrolira difuzija topljenca s površine delca v glavno maso topila, potem fina mletev materiala nima posebnega učinka. V tem primeru pospešimo ekstrakcijo z intenzivnejšim mešanjem fluida. V primeru, ko je topljenec porazdeljen po trdni snovi, ki je nepropustna za topilo, v obliki majhnih izolirnih zrn, moramo material zdrobiti, tako da je ves topljenec izpostavljen topilu. [29] 2.6 Konvencionalna topila Donosi ekstrakcije so močno odvisni od narave oz. izbire topila. Organska topila kot sta metanol in etanol, se pogosto uporabljajata za pridobivanje polifenolov iz naravnega vira. Najbolj primerne so vodne mešanice, ki vsebujejo metanol, etanol, aceton in etil acetat. Z namenom pridobivanja ekstraktov z boljšimi izkoristki in nižjimi stroški, so bili razviti številni načini ekstrakcije. Na splošno je večina polisaharidov pridobljena z uporabo metode vodne ekstrakcije in percipitacijo z alkoholom. Postopek priprave gobne biomase za ekstrakcijo polisaharidov je odvisen od vrste gobe oz. njenega dela. Trosnjake, vzgojene na trdnih gojiščih se posuši in zmelje. Micelij, vzgojen v tekočem gojišču, se najprej ločiti od gojišča s filtracijo, nato se ga ekstrahira svežega ali posušenega. Pred samo izolacijo polisaharidov iz grobih ekstraktov se trosnjake ali micelij ekstrahira z etanolom ali metanolom. S tem korakom se odstranijo preostanki zunajceličnih polisaharidov, inaktivirajo se encimi, ki bi lahko povzročili hidrolizo endopolisaharidov, odstranijo se nizko molekularne snovi, nečistoče in lipidi. [1] Dobitek ekstrakcije ni odvisen samo od naravnega materiala, temveč tudi od različnih ekstrakcijskih parametrov, kot so npr.: temperatura, tlak, ph, ionska moč topila. Ekstrakcija z vročo vodo je najbolj pogost postopek pridobivanja polisaharidov iz G. lucidium. Pogosta je uporaba kislin, soli in razredčenih alkalnih raztopin, ki služijo za razkroj celične stene. 12

Za razkroj celične stene se uporabljajo tudi druge metode, kot so mikrovalovi, ultrazvok ali kombinacija obeh. [11, 12] Z uporabo metode Sevag se iz grobega ekstrakta, bogatega s polisaharidi odstranijo še proteini. Obarjanje z etanolom, metoda zamrzovanja-taljenja in kolonska kromatografija omogočajo pridobivanje čistih oblik polisaharidov. Najpogostejši kromatografski metodi za čiščenje sta ionsko- izmenjevalna kromatografija in gelska filtracija. [12] Ekstrakcije z etanolom veljajo za najlažji pristop za ohranitev delovanja triterpenov. Triterpene lahko ekstrahiramo tudi z uporabo organskih topil, kot so metanol, etanol, kloroform ali eter, ki jim sledijo različne metode ločevanja. Heksan se uporablja predvsem za pridobivanje maščobnih kislin. Ekstrakcije z metanolom ali metanolne ekstrakcije veljajo predvsem za čiščenje oz. za odstranitev drugih snovi (fenolne spojine, monosaharidi, aminokisline in druge sorodne molekule). [30] Slika 2-4 prikazuje polarnost najbolj uporabljenih topil za ekstracijo. Slika 2-5: Prikaz polarnosti najbolj uporabljenih topil za ekstrakcijo [31] 2.6.1 Metanol Metanol je spojina s formulo CH 3 OH, najenostavnejši alkohol, ki je pri sobnih pogojih lahko hlapna, brezbarvna in vnetljiva kapljevina, s podobno a nekoliko slajšo aromo kot etanol. Spojina nastaja naravno kot stranski produkt anareobnega metabolizma bakterij, zato je v majhnih količinah prisoten v obliki hlapov v ozračju. V preteklosti so ga pridobivali s suho destilacijo lesa, zato je dobil ljudsko ime lesni alkohol, danes pa ga industrijsko pridobivajo predvsem z reakcijo ogljikovega oksida in vodika, katalizitano z zmesjo bakra in cinkovega ter aluminijevega oksida. [32] 2.6.2 Etanol Etanol, tudi etilni alkohol, je alkohol s kemijsko formulo je C 2 H 5 OH. Etanol je pri sobni temperaturi brezbarvna kapljevina, večini prijetnega duha. Vsebujejo ga alkojolne pijače. V 13

večjih količinah in koncentracijah je strupen. Uživanje etanola pri ljudeh povzroča kratkotrajne, včasih ugodne psihofizične odzive in zasvojenost. Etanol v naravi predelujejo glive kvasovke iz sladkorja z alkoholnim vrenjem, pridobiva se ga tudi v petrokemiji, iz naftnih derivatov, zlasti z oksidacijo etilena. Kvasovke pri večji koncentraciji etanola odmrejo, zato je neposredno z vrenjem možno doseči do največ 25 % prostorninski delež etanola. Večjo koncentracijo dobimo z destilacijo. Z destilacijo ni možno doseči 100-odstotne čistosti etanola, temveč le do teoretično 95,7 %. [33] 2.6.3 Aceton Aceton (tudi propanon, dimetil keton, 2-propanon in propan-2-on) je najpreprostejši keton s kemijsko formulo CH 3 (CO)CH 3. Aceton je brezbarvna, hlapna in vnetljiva tekočina. Meša se z vodo in skoraj vsemi organskimi topili, zato je pomembno laboratorijsko in industrijsko topilo. Letna svetovna proizvodnja acetona je več kot tri milijone ton, od katerih se večina porabi v industriji polimerov, barvnih premazov in nekaterih razstreliv. V vsakdanji rabi se največ acetona porabi za odstranjevanje laka za nohte. V naravi se nahaja v majhnih količinah v praženi kavi in lanu, v katerem nastaja z razpadom linamarina, in v tobaku. V majhnih količinah nastaja tudi v človeškem organizmu iz amino kislin, maščob in ogljikovih hidratov. [34] 2.6.4 Heksan Heksan je ogljikovodih z molekulsko formulo C 6 H 14. Heksan je brezbarvna vnetljiva tekočina, ki jo pridobivajo s frakcionirno destilacijo nafte in se uporablja kot topilo in delovna tekočina v nizko temperaturnih termometrih. n- heksan je alifatski ogljikovodik; obstaja več njegovih izomer. Nerazvejana oblika je n- heksan. Je sestavina v parafinski frakciji surove nafte in zemeljskega plina in se uporablja tudi kot industrijska kemikalija in labaratorijski reagent. V visoko očiščeni obliki je heksan v kemijskih laboratorijih uporaben za ekstrakcije, saj lahko ekstrahira širok spekter ogljikovodikov in nepolarnih organskih spojin. Skoraj vsi n- heksani so pridobljeni iz naftnih mešanic z nadzorovano frakcionirno destilacijo in drugimi procesi rafinacije. Heksan lahko sintetiziramo tudi iz odpadkov sladkornega trsa z uporabo posebnih katalizatorjev. Ta vrsta sinteze je relativno nova in količina proizvodnje je še vedno zelo omejena. Heksan se uporablja predvsem za ekstrakcijo jedilnih olj iz različnih posevkov, kot so soja, bombaž, ogrščica (oljna repica), lan, gorčično seme, arašidi, semena žafranke in koruznih kalčkov. Uporablja se kot topilo in čistilno sredstvo za razmaščevanje, v tekstilni, obutveni in usnjarski industriji ter pri proizvodnji pohištva. Uporablja se tudi v tiskarski industriji kot čistilo in kot sestavni del nekaterih barv. [35] 14

2.6.5 Voda (H 2 O) Voda je spojina, ki je sestavljena iz dveh atomov vodika (H) in enega atoma kisika (O), ki so skupaj povezani s kovalentno vezjo. Voda je edina snov, ki se pri običajnih temperaturah na Zemlji pojavlja v vseh treh agregatnih stanjih- tekočem, plinastem in trdnem. Sprememba agregatnega stanja je povezana z oddajanjem oz. sprejemanjem energije. Voda je topilo, ki raztaplja več snovi kot katero koli drugo topilo. Čiste vode v naravi ne poznamo. Kot topilo deluje tudi v našem telesu, saj vse biokemične reakcije potekajo v vodnih raztopinah. Voda je hkrati kot transportni medij za prenos hranil in kisika do celic ter odstranjevanje odpadnih snovi presnove. Topnost snovi v vodi je odvisna predvsem od vrste snovi in temperature. Ker je voda polarno topilo, se v njej dobro raztapljajo polarne in ionske snovi, slabo topne pa so nepolarne snovi, kot so npr. maščobe in olja. [36] 2.7 Kemijske analize 2.7.1 Določanje skupnih sladkorjev 2.7.1.1 Metoda reakcije sladkorjev z aromatskimi fenoli Metoda reakcije sladkorjev z aromatskimi fenoli ali PSA metoda se uporablja za kvantitativno določanje skupnih sladkorjev. Metoda je hitra in enostavna, vendar kadar se uporablja za vzorce iz okolja, je njena ponovljivost lahko nizka. Koncentrirana žveplova (VI) kislina hidrolizira glikozidne vezi v polisaharidu iz monosaharidnih enot. Po odcepu vode nastanejo furfurali in njegovi derivati, ki dajejo z aromatskimi fenoli (kot so fenol, naftol, anthron, resorcinol, itd.) intenzivno obarvane produkte, ki absorbirajo pri valovni dolžini 480-490 nm. Kondenzacija slednjih spojin s fenolno skupino daje oranžno-rumeno barvo. [38] 2.7.2 Določanje skupnih fenolov 2.7.2.1 Metoda za določanje vsebnosti skupnih fenolov Vsebnost skupnih fenolov se določa na osnovi oksidacijske reakcije fenolnih spojin s Folin- Ciocateu reagentom. Pri tem poteče reakcija H 3 PW 12 O 40 in H 3 PMo 12 O 40 kislin s fenolnimi spojinami v alkalnem mediju, pri čemer nastane zmes modrih oksidov. Določanje vsebnosti skupnih fenolov poteka spektrofotometrično, z merjenjem absorbance nastalega barvnega kompleksa pri valovni dolžini 760 nm. Za določanje skupnih fenolov se kot standard uporablja galna kislina. [39] Fenolne spojine lahko tudi določimo spektrofotometrično z merjenjem absorbance pri valovni dolžini 280 nm, saj absorbirajo ultravijolično svetlobo. Pomanjkljivost te metode je, da posamezni fenoli različno absorbirajo (imajo različen ekstinkcijski koeficient) pri 280 nm, zato se rezultati ne morejo izraziti na določen standard, ampak se podajo kar v 15

absorbančnih enotah ob upoštevanju razredčitvenega faktorja. Prednost te metode je, da je zelo preprosta za uporabo in hitra, vključuje lahko le filtracijo in redčenje. [40] 2.7.3 Določanje skupnih proteinov Za določanje skupnih proteinov v ekstraktih se uporabljajo naslednje analitske metode: Bradfordova, Biuretska in Loweryjeva metoda. 2.7.3.1 Bradfordova metoda Koncentracija proteinov se največkrat določa z metodo po Bradfordu. Metoda temelji na reakciji beljakovin z barvilom Coomassie Brilliant Blue G- 250 (BIO- RAD). Pri tej reakciji nastane obarvan produkt, ki ima absorbcijski maksimum pri 595 nm. Koncentracijo proteinov odčitamo iz umeritvene krivulje narejene iz raztopin govejega serumskega albumina, kot standarda, pri čemer je absorbanca obarvane raztopine proporcionalna koncentraciji proteinov v vzorcu. [39] 2.7.3.2 Biuretska metoda Metoda temelji na reakciji peptidne vezi z bakrom v bazičnem in v prisotnosti kalijnatrijevega tartrata, kar povzroči formacijo vijoličnega kompleksa in ima absorpcijski vrh pri 540-560 nm. Dobra lastnost te metode je, da ni interakcij med prostimi aminokislinami in ni velike odvisnosti aminokislinske sestave, ker baker reagira s peptidno verigo in ne s stranskimi skupinami. Glavna pomanjkljivost, ki močno omejuje njeno uporabo, je njena nizka občutljivost: 1-6 mg proteina ml. [41] 2.7.3.3 Loweryjeva metoda Podobno kot biuretska metoda temelji na rekciji med peptidno vezjo in bakrom, vendar redukcija Folin-Ciocalteaujevega reagenta povzroči nastanek vijolično obarvanega kompleksa. Metoda je bolj občutljiva kot biuretska reakcija (0,1-1 mg proteina ml). Za potek reakcije je zelo pomembna vrednost ph, ki mora biti med 10 in 10,5. Prednost te metode je kot rečeno visoka občutljivost, saj z redčenjem vzorca redčimo tudi moteče snovi in s tem zmanjšujemo njihov škodljiv vpliv. [41] 2.7.4 Tankoslojna kromatografija (TLC) Kromatografija je fizikalna metoda separacije, kjer se komponente vzorca ločujejo na osnovi različnih mehanizmov, ki so določeni s stacionarno in mobilno fazo. Mobilna faza potuje skozi stacionarno fazo v določeni smeri. Kromatografska separacija je posledica razlik v hitrosti potovanja posameznih komponent na stacionarni fazi. Kromatografski proces je rezultat ponavljajočega se procesa ali topnosti in netopnosti ali sorpcije in desorpcije s stacionarno fazo. Do separacije pride zaradi razlik v porazdelitvenih konstantah posameznih komponent vzorca, ki so posledica različnih kemijskih in fizikalnih lastnosti topljenca. 16

Pri tankoplastni kromatografiji je trdna stacionarna faza (npr. silikagel) premazana na nosilno ploščo. Z zelo majhnimi in enotnimi delci je separacija zelo učinkovita, zato so lahko plošče zelo majhne. Topilo (mobilna faza) je po navadi mešanica dveh, treh ali štirih komponent. Postopek po navadi izvedemo v posebnih steklenih posodah, tako da je spodnji rob plošče potopljen v topilo. Ekstrakt je nanešen na rob plošče, po navadi z mikro pipeto, nad nivojem topila (slika 2-3). Postopek je končan, ko topilo doseže zgornji rob plošče in kot rezultat dobimo kromatogram. Separacija komponent v raztopini je prikazana v obliki lis, ki fluorescirajo in so vidne šele z UV lučjo. Nekatere lise na kromatogramu so vidne že s prostim očesom, po gretju v peči (se temno obarvajo), ali z orositvijo s posebnim reagentom. Razmerje med spremembo višine lise določene komponente in spremembo višine lise topila imenujemo retenzijski faktor (R f ), ki je značilen za določeno komponento pri danih pogojih. Za določitev retenzijskega faktorja potrebujemo razdaljo med startom in koncem poti topila in razdaljo določene komponente. R f (A) = razdalja komponente A od starta razdalja topila od starta Vrednost R f je odvisna od kvalitete sorbenta (stacionarna faza), od debeline premaza, mobilne faze (pazimo, da katera od komponent topila ne izhlapi), lastnosti in množine snovi in temperature. [42] Slika 2-6: Kromatografska plošča z nanešenim vzorcem [43] 2.8 Biološka aktivnost 2.8.1 Določanje antioksidativne aktivnosti 2.8.1.1 DPPH radikalska metoda Pri ugotavljanju sposobnosti antioksidantov za lovljenje radikalov se v veliki meri uporablja DPPH radikal, ki je eden redkih stabilnih organskih radikalov. Metoda temelji na 17

reakciji DPPH radikala z antioksidantom, pri čemer gre predvsem za prenos elektrona. Sposobnost antioksidanta, da vstopi v reakcijo z DPPH radikalom in s tem zniža vsebnost omenjenega radikala, se lahko oceni z elektronsko spinsko resonanco ali spektrofotometrično pri valovni dolžini 517 nm, kjer je absorbcijski maksimum radikala. Boljša kot je antioksidativna učinkovitost, manjši delež radikala preostane v reakcijski zmesi in nižja je absorbanca. Prednost te metode je njena preprostost. Zato je zelo razširjena in splošno uporabljena za določanje antioksidativne učinkovitosti. Slabosti metode se pojavijo, ko analiziran vzorec vsebuje snovi, ki imajo podoben absorbcijski spekter pri karakteristični valovni dolžini kot DPPH. Take interference še posebej ustvarjajo karotenoidi in drugi pigmenti. [8] 2.8.1.2 Luminescenčne metode Luminescenca je fizikalni pojav, pri katerem snov, ki ni močno segreta, seva elektromagnetno valovanje. Poznamo več luminescenčnih metod za določanje antioksidantov, pri katerih se uporabljajo različni reagenti, ki ob prisotnosti prostih radikalov preidejo v vzbujeno stanje, kar povzorči emisijo svetlobe. Med najbolj pogostimi reagenti so lucigenin, izoluminol in luminol. Luminol je po svoji zgradbi 5- amino-2,3 dihidroftalazin-1,4 dion ali 3-aminoftalhidrazid. Snov, ki je potrebna za začetek oksidacije luminola v vodnih raztopinah je superoksidni radikalni anion O 2 -. Ta snov se tvori v vodni raztopini z razpadom H 2 O 2 v prisotnosti kakšnega prostega radikala. V zelo bazičnih vodnih sistemih pride do razpada H 2 O 2 s pomočjo katalize, ki jo povzročajo oksidacijski aktivatorji, drugače pa lahko razpade s pomočjo encima peroksidaze. [44] 2.8.1.3 ABTS + radikalska metoda Ena izmed najpogosteje uporabljenih metod je indirektna metoda določanja antioksidativnega potenciala z ABTS + radikalom. Radikal ABTS + je hkrati kation in kromofor, ki ima karakterističen absorbcijski spekter z maksimumi pri valovnih dolžinah 414, 645, 734 in 815 nm (v literaturi je največ poskusov opravljenih pri valovni dolžini 414 nm). Radikal lahko pridobimo iz ABTS (2,2-azobis-3-etilbenzotiazolin-6-sulfonska kislina) na različne načine, in sicer z encimsko peroksidazo; kemijsko z MnO 2, kalijevim persulfatom ali peroksidnimi radikali; ter elektrokemijsko. V odsotnosti fenolnih snovi je radikal precej stabilen, v prisotnosti donorja vodikovega atoma (fenoli) pa hitro reagira in postane brezbarven. Zmanjšanje radikala je proporcionalno koncentraciji in aktivnosti antioksidanta v analiziranem vzorcu. Radikal ABTS + je topen v vodnih in organskih topilih in se lahko uporablja za določanje antioksidativne aktivnosti tako hidrofilnih kot lipofilnih antioksidantov. Prednost ABTS metode je predvsem njena preprosta uporaba in možnost za rutinske analize v vsakem laboratoriju. Slabost metode je, da podaja sposobnost spojin za reakcijo z ABTS +, saj reagira z OH skupinami v aromatski spojini, ne glede na to, ali te prispevajo k antioksidativni aktivnosti ali ne. [40] 18

2.8.2 Določanje zaviranja encima acetilholinesteraze (AChE) 2.8.2.1 Ellmanova metoda Ellmanova metoda za določanje aktivnosti encima acetilholinesteraze (AChE) in njegove inhibicije z ekstrakti (Ellman in sod., 1961) temelji na uporabi alternativnega substrata acetiltioholina in 5,5- ditiobis- 2 nitrobenzojske kisline (DNTB) z merjenjem absorbance pri 412 nm. [45] 19

3 Eksperimentalni del 3.1 Laboratorijski pribor, aparature in kemikalije Steklovina in pribor Aparature Kemikalije bučka z okroglim dnom magnetno mešalo erlenmajerica z ravnim dnom (250ml) merilni valj (100 ml) steklena palčka, žlička nuča z nastavkom za nučiranje in gumico filtrni papir spatula, plastične posodice za ekstrakte uparjalnik (Rotavapor) laboratorijska tehtnica analitska tehnica (L2200P) eksikator metanol etanol aceton heksan destilirana voda 3.2 Priprava osnovnega materiala Posušene trosnjake in primodije G. lucidum, smo zmleli s kavnim mlinčkom ter jih hranili na suhem mestu do postopka ekstrakcije. 3.3 Konvencionalna ekstrakcija z organskimi topili (hladna, vroča) Ob uporabi topil smo pri sobni temperaturi in pri temperaturi vrelišča topila izvedli konvencionalno ekstrakcijo primodijev (P) ter trosnjakov (T) G. lucidum. Za topilo smo uporabili metanol, etanol, aceton, heksan in vodo. Vse ekstrakcije smo izvedli v laboratoriju za Separacijske procese in Produktno tehniko, na Fakulteti za kemijo in kemijsko tehnologijo, Univerze v Mariboru. 20

3.3.1 Vroča ekstrakcija Zatehtali smo 5g mletega materiala v bučko z okroglim dnom, dodali 100 ml izbranega topila (metanol, etanol, aceton, heksan) in magnetni mešalček. Bučko smo namestili v oljno kopel (slika 3-1 levo), ki smo jo predhodno segreli na temperaturo vrelišča topila, namestili povratni hladilnik in vklopili mešanje. Zmes smo enakomerno mešali 3 ure, nato pa ekstrakcijsko zmes prefiltrirali s pomočjo nuče in podtlaka preko filtrnega papirja. Raztopino ekstrakta smo prelili v bučko z okroglim dnom, ostanek na filter papirju pa zavrgli. Bučko smo namestili na rotavapor in odparili topilo, vendar ne do suhega. Koncentriran ekstrakt smo nato prelili v stehtane vijale in topilo odparili iz ekstrakta tako, da smo ga prepihavali z N 2. Vijale smo nato stehtali in na osnovi razlike mas določili maso ekstrakta ter izračunali izkoristek ekstrakcije. Izkoristek ekstrakcije smo računali po enačbi: η (%) = m ekstrakt m material 100 m ekstrakta = m vijale + ekstrakt - m bučka Kjer je: η izkoristek (%) m ekstrakta masa zatehtane G. lucidum (g) m vijale + ekstrakta masa vijale in ekstrakta (g) m vijale masa prazne vijale (g) 3.3.2 Hladna ekstrakcija Zatehtali smo 5 g zmletega materiala in ga ekstrahirali s 100 ml izbranega topila (metanol, etanol, aceton, heksan). Ekstrakcijo smo izvajali v zaprti 250 ml erlenmajerici (slika 3-1, desno), ter zmes mešali z magnetnim mešalom 3 ure pri sobni temperaturi (25 C). Naprej je sledil enak postopek kot je opisano pod točko 3.3.1. 21

Slika 3-1: Konvencionalna ekstrakcija; vroča ekstrakcija- levo in hladna ekstrakcija- desno 3.3.3 Ekstrakcija fenolov, proteinov in polisaharidov Zatehtali smo 5 g zmletega materiala in ga ekstrahirali s 100 ml metanola. Ekstrakcijo smo izvajali v zaprti 250 ml erlenmajerici, ter zmes mešali z magnetnim mešalom 3 ure pri sobni temperaturi. Po končani ekstrakciji smo ekstrakcijsko zmes odfiltrirali s pomočjo nuče in podtlakom preko filtrnega papirja. Tekoči del smo uparili in dobili ekstrakt bogat s fenoli. Ostanek materiala na filter papirju smo nadalje ekstrahirali z vodo pri 100 C, 6 ur. Po končani ekstrakciji smo ekstrakcijsko zmes ponovno filtrirali, ter shranili filtrat in ostanek na filter papirju. Preostanek s filter papirja smo dalje ekstrahirali v 2 ut% vodni raztopini NaOH pri 100 C, 3 ure, filtrat smo razdelili na 3 enake dele: čisti vodni dodamo EtOH v razmerju 3:1 dodamo trifloroocetno kislino skupaj z filtratom od ekstrakcije z NaOH Proteine smo odstranili z obarjanjem z dodatkom 20 ut% trifloroocetne kisline, katere smo pozneje ločili s centrifugiranjem. 22

Po odstranitvi proteinov smo polisaharide oborili z dodatkom etanola v razmerju 2:1. Poenostavljen shematski prikaz pridobivanja polisaharidov, proteinov in fenolov je prikazan na sliki 3-2. Slika 3-2: Poenostavljen shematski prikaz pridobivanja polisaharidov, proteinov in fenolov [11] 3.4 Kemijska analiza ekstraktov 3.4.1 Določanje vsebnosti totalnih fenolov Najprej smo pripravili umeritveno krivuljo z osnovno raztopino galne kisline (GA) v metanolu s koncentracijo 0,4 mgml (10 mg GA smo zatehtali v 25 ml merilno bučko in razredčili z metanolom do oznake). Nato smo v 10 ml merilne bučke odpipetirali sledeče volumne osnovne raztopine GA: 2,5 ml, 1,75 ml, 1,00 ml, 0,75 ml, 0,50 ml, 0,25 ml, 0,10 ml ter razredčili do oznake z metanolom. Raztopino smo dobro premešali. V stekleničke smo odpipetirali 0,5 ml razredčene GA, dodali 2,5 ml raztopine Folin- Ciocalteu reagenta ter 2 ml raztopine Na 2 CO 3, raztopino premešali in termostatirali v vodni kopeli 5 min pri temeperaturi 50 C. Nato smo raztopine ohladili in izmerili absorbanco pri 760 nm. Hkrati 23

Absorbanca pri 760 nm Ekstrakcija biološko aktivnih spojin iz Ganoderme lucidum ob uporabi organskih topil in smo pripravili slepi vzorec, kjer smo namesto raztopine GA uporabili metanol. Na osnovi izmerjenih absorbanc smo narisali diagram odvisnosti absorbance (Abs) od koncentracije GA (γ GA ) v raztopinah ( Abs = f (γ GA )), ki je prikazan na sliki 3-3. 1,0 0,9 0,8 y = 8,5587x + 0,0742 R² = 0,9959 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0,0 0,00 0,02 0,04 0,06 γ GA [mgml] 0,08 0,10 0,12 Slika 3-3: Umeritvena krivulja z galno kislino V merilne bučke V= 1ml smo nato zatehtali 2 mg ekstrakta in dopolnili do oznake z metanolom. 0,5 ml raztopine ekstrakta smo odpipetirali v stekleničko, dodali 2,5 ml raztopine Folin- Ciocalteu reagenta (razredčenega z vodo v razmerju 1:10) ter 2 ml raztopine Na 2 CO 3 (75 gl). Čas za pripravo vzorca ne sme biti daljši od 2 min. Tako pripravljene vzorce smo termostatirali v vodni kopeli 5 min pri temperaturi 50 C. Raztopine smo nato ohladili in izmerili absorbanco pri 760 nm. Za pripravo kontrolnega vzorca smo namesto raztopine ekstrakta odpipetirali metanol. Kontrolni vzorec smo uporabili za umerjenje spektrofotometra. Koncentracijo totalnih fenolov smo v ekstraktih izračunali s pomočjo umeritvene krivulje GA po sledeči enačbi: Abs = a γ GA + b Kjer je: Abs absorbanca raztopine vzorca izmerjena pri 760 nm b odsek premice umeritvene krivulje GA na osi absorbance a naklon premice umeritvene krivulje GA (mlmg) γ GA koncentracija GA v raztopini ekstrakta (mgml) Rezultate vsebnosti totalnih fenolov izrazimo v mg GA na G ekstrakta (W GA ekstrakta ) oz. mg GA na g materiala (W GA materiala ) po sledečih enačbah: 24

W GA ekstrakt = γ GA γ ekstrakt 1000 W GA material = W GA ekstrakt η ekstrakcije 100 Kjer je: γ GA koncentracija GA v raztopini ekstrakta (mgml) γ ekstrakta koncentracija ekstrakt v raztopini vzorca (mgml), ki se izračuna na osnovi mase zatehte ekstrakta (m ekstrakta, v mg), ki smo ga pripravili za analizo γ ekstrakta = m ekstrakta V razt. η ekstrakcije izkoristek ekstrakcije [39] 3.4.2 Bradfordova metoda za določanje skupnih proteinov Bradford- ov reagent smo pripravili tako, da smo raztopili 100 mg Coomassie Brilliant Blue (CBB) v 50 ml 95% etanola in v 100 ml 85% (vv) fosforne kisline (H 3 PO 4 ), ter razredčili z Mili-Q vodo do oznake 1 L. Za pripravo umeritvene krivulje (slika 3-4) smo uporabili protein albumin v koncentracijskem območju od 0 do 1 mgml. Pripravili smo si koncentracije albumina. Zatehtamo 10 mg albumina in dodamo 1 ml Mili-Q vode. 10 mgml razredčimo po naslednjem principu: Samo Milli-Q voda (slepa proba) 0,0 mgml 20 µl albumina (10 mgml) + 980 µl Milli-Q vode 0,2 mgml 40 µl albumina (10 mgml) + 960 µl Milli-Q vode 0,4 mgml 60 µl albumina (10 mgml) + 940 µl Milli-Q vode 0,6 mgml 80 µl albumina (10 mgml) + 920 µl Milli-Q vode 0,8 mgml 100 µl albumina (10 mgml) + 900 µl Milli-Q vode 1,0 mgml Pripravljenim raztopinam odvzamemo 20 µl in jim dodamo 1 ml pripravljenega Bradfordovega reagenta ter premešamo. Raztopinam izmerimo absorbcijo pri valovni dolžini 595 nm. 25

Absorbanca pri 595 nm Ekstrakcija biološko aktivnih spojin iz Ganoderme lucidum ob uporabi organskih topil in 0,8 0,7 y = 0,6759x + 0,0049 R² = 0,9857 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 γ (mgml)γ Slika 3-4: Umeritvena krivulja za določanje totalnih beljakovin Za določanje proteinov v ekstraktih smo odpipetirali 50 µl ekstrakta in 50 µl Tris- HCl, ph 7,0 pufra, temu pa smo dodali 5 ml 1:4 razredčenega in prefiltriranega BIO- RAD (CBB) barvila in vse dobro premešali. Vzorce smo pripravili v dveh paralelkah. Slepi vzorec smo pripravili tako, da smo 100 µl Tris- HCl pufra, ph 7,0, dodali 5 ml 1:4 razredčenega in prefiltriranega BIO- RAD(CBB) barvila. Po 10 minutah smo vzorec ponovno premešali, prelili v plastično kiveto in izmerili absorbanco pri 595 nm. [39] 3.4.3 Določanje skupnega sladkorja v surovih polisaharidih Umeritvena krivulja Umeritveno krivuljo (slika 3-5) smo analizirali v koncentracijskem območju (4,7*10-3, 9,4*10-3, 18,8*10-3, 75,1*10-3, 150,1*10-3 ) mgml glukoze, z merjenjem absorbance pri 490 nm. 26

Abs 490 nm Ekstrakcija biološko aktivnih spojin iz Ganoderme lucidum ob uporabi organskih topil in 0,45 0,4 y = 2,7472x + 0,0012 R² = 0,9937 0,35 0,3 0,25 0,2 0,15 0,1 0,05 0 0 0,02 0,04 0,06 0,08 0,1 0,12 0,14 0,16 CGLC(mgml) Slika 3-5: Umeritvena krivulja za določanje skupnega sladkorja v polisaharidih Vsebnost sladkorjev v vzorcu polisaharidov G. lucidium smo določili z uporabo metode fenol- žveplove kisline. 1 mg vsakega vzorca smo raztopili v 10 ml destilirane vode. 1 ml te raztopine smo dodali 1 ml 5 % fenolne raztopine in 5 ml koncentrirane žveplove kisline (H 2 SO 4 ). Tako pripravljeno raztopino smo mešali pol ure in nato izmerili absorbanco pri 490 nm. Vsebnost sladkorja smo izračunali na podlagi umeritvene krivulje. Vse meritve smo ponovili tri krat. [] 3.5 Biološka aktivnost ekstraktov 3.5.1 Določanje antioksidativne aktivnosti z radikalsko metodo V merilno bučko V= 1 ml smo zatehtali 1 mg ekstrakta ter ga razredčili do oznake z metanolom. Vzorec smo dobro premešali, da se je ekstrakt popolnoma raztopil. Pripravili smo tudi 6 X 10-5 M raztopino DPPH v metanolu. V temno stekleničko smo odpipetirali 3 ml raztopine DPPH in 77 µl raztopine ekstrakta, zmešali in tako pripravljen vzorec termostatirali 15 min pri sobni temperaturi v temnem prostoru. Nato smo izmerili absorbanco raztopine pri 515 nm. Referenčno raztopino smo pripravili enako kot vzorec le, da smo namesto raztopine vzorca odpipetirali 77µl metanola in absorbanco izmerili takoj. Antioksidativno aktivnost smo podali kot % inhibicije glede na referenčno raztopino in jo izračunali po enačbi: % inhibicije = ( A c 0 A s 15 Kjer je: A c 0 ) 100 A c 0 absorbanca referenčne raztopine v času 0 min 27

A s 15 absorbanca raztopine vzorca v času 15 min [39] 3.5.2 Določanje inhibicije encima acetilholinesteraze Aktivnost encima acetilholiesteraze (AChE) in njeno inhibicijo z ekstrakti smo zasledovali z Ellmanovo metodo (Ellman in sod., 1961) s pomočjo čitalca mikrotitrnih plošč. Kot encim smo uporabili AChE iz električne jegulje. Pred poskusom smo prav tako pripravili mešanico 5 ml Ellmanovega reagenta. Za testiranje vpliva ekstraktov na AChE smo uporabili 100 µl mešanice Ellmanovega reagenta in acetilholin klorida. Nato smo v posamezno vdolbinico dodali 5 µl vsakega ekstrakta ter 45 µl mešanice AChE v fosfatnem pufru. Pri kontrolnem poskusu smo mikrotitrne plošče napolnili z mešanico 100 µl Ellmanovega reagenta in substrata, 5 µl topila ter 45 µl mešanice AChE in fosfatnega pufra. Rezultat smo podali kot % inhibicije. [46] 28

4 Rezultati in diskusija 4.1 Trosnjaki 4.1.1 Sejalna analiza G. lucidum smo zmleli s kavnim mlinčkom. Nato smo izvedli sejalno analizo. Meritve in izračuni so podani v tabeli 4-1. Tabela 4-1: Meritve in izračuni sejalne analize zmletih trosnjakov Št. sit Velikost zanke d (mm) Razpon frakcije (mm) Interval d zanke (mm) TROSNJAKI m= 15 g Masa frakcije Gi (g) Ri (%) Σ(Ri +Ri+1) (%) Srednja velikost d (mm) R (%) R dzanke (%mm) 1 4,00 nad 4 ~ 1,10 8,31 8,31 ~ ~ ~ 2 3,15 3.15-4.0 0,85 1,08 8,16 16,47 3,58 8,16 9,60 3 2,50 2.5-3.15 0,65 0,77 5,82 22,28 2,83 5,82 8,95 4 2,00 2.0-2.5 0,50 2,00 15,11 37,39 2,25 15,11 30,21 5 1,60 1.6-2.0 0,40 1,93 14,58 51,96 1,80 14,58 36,44 6 1,00 1.0-1.6 0,60 1,40 10,57 62,54 1,30 10,57 17,62 7 0,80 0.8-1.0 0,20 0,75 5,66 68,20 0,90 5,66 28,32 8 0,63 0.63-0.80 9 0,50 0.50-0.63 10 0,40 0.40-0.50 0,17 0,52 3,93 72,13 0,72 3,93 23,10 0,13 0,48 3,63 75,76 0,57 3,63 27,89 0,10 0,20 1,51 77,27 0,45 1,51 15,11 11 dno ~ 3,010 22,73 100,00 ~ ~ ~ 12 Vsota frakcij 13,24 100 Mediansko zrno lahko odčitamo iz integralne krivulje porazdelitve mas (slika 4-1) pri R = 50 % in znaša 1,55 mm. Prav tako lahko iz krivulje odčitamo podatke za izračun koeficienta enakomerne zrnatosti: k = d(r 25) = 2,4 d(r 75 ) 0,5 = 4,8, kar pomeni, da je zrnatost neenakomerna, sa je k > 1,5. 29

Diferencialna porazdelitev mas Rsred.d (%mm) Integralna porazdelitev mas R(%) Ekstrakcija biološko aktivnih spojin iz Ganoderme lucidum ob uporabi organskih topil in 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 0,0 1,0 2,0 3,0 4,0 5,0 Velikost zrn (mm) Slika 4-1: Krivulja integralne porazdelitve mas zmletih trosnjakov 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 0,85 0,65 0,50 0,40 0,60 0,20 0,17 0,13 0,10 Srednja velikost zrn (mm) Slika 4-2: Krivulja diferencialne porazdelitve mas zmletih trosnjakov 30

Maksimum diferencialne krivulje porazdelitve mas nam predstavlja najpogosteje zastopano zrno. V primeru zmletih trosnjakov je to zrno velikosti 0,40 mm. V tabeli 4-2 smo zbrali rezultate sejalne analize zmletih trosnjakov. Tabela 4-2: Rezultati sejalne analize za trosnjake Mediansko zrno [mm] Najpogosteje zastopano zrno [mm] Koeficient zrnatosti Enakomerna neenakomerna zrnatost 1,55 0,40 4,8 neenakomerna 4.1.2 Konvencionalna ekstrakcija trosnjakov G. lucidum z organskimi topili Izvedli smo vročo (v) in hladno (h) konvencionalno ekstrakcijo trosnjakov (T), pri katerih smo uporabili naslednja topila: metanol (MeOH), etanol (EtOH), aceton (AcOH) in heksan (Hex). Po končanih ekstrakcijah smo izračunali izkoristek (η) in rezultati so prikazani v tabeli 4-3. Iz tabele 4-3 je razvidno, da smo največji izkoristek dobili pri ekstrakciji z MeOH (η = 9,33 %), sledijo EtOH (η = 6,15 %), AcOH (η = 3,58 %) in Hex (η = 1,42 %). Vpliv temperature beležimo pri topilu Hex, kjer ekstrakcija z vročim topilom poviša izkoristek za 1%. V primeru EtOH je izkoristek za 2% višji pri uporabi hladnega topila. Tabela 4-3: Izkoristek vroče (v) in hladne (h) ekstrakcije (η v %) trosnjakov (T) ob uporabi različnih organskih topil: metanol (MeOH), etanol (EtOH), aceton (AcOH) in heksan (Hex). Topilo vroča oz. hladna ekstrakcija Izkoristek (η[%]) T-h- MeOH 9,2 T-v- MeOH 9,33 T-h- EtOH 6,15 T-v- EtOH 4,22 T-h- AcOH 3,58 T-v- AcOH 3,15 T-h- Hex 1,42 T-v- Hex 2,4 Iz tabele 4-3 je razvidno, da na izkoristek ekstrakcije vpliva polarnost topila, kjer beležimo največji izkoristek pri najbolj polarnem topilu MeOH. Sledijo EtOH, AcOH in Hex. Zaključujemo, da je velik odstotek (%) spojin v trosnjakih polarne narave. Ekstrakcije z MeOH veljajo predvsem za ekstrakcijo fenolnih spojin, monosaharidov, aminokislin in drugih polarnih spojin. Hex je med izbranimi topili nepolaren in se uporablja predvsem za pridobivanje maščobnih kislin. Pri uporabi Hex kot topila beležimo najmanjši izkoristek, 31

T- h -EtOH T- v- EtOH T- h- AcOH T- v- AcOH T- h- hex T- v- hex T- h- MeOH T- v- MeOH Vsebnost skupnih fenolov mg GA ex. g ex. % Ekstrakcija biološko aktivnih spojin iz Ganoderme lucidum ob uporabi organskih topil in kar sovpada z nizkim deležem maščobnih kislin v gobi G. lucidum (Lv in sod., 2012). V primeru Hex je izkoristek višji pri vroči ekstrakciji, kar sovpada s tem da so maščobne kisline G. lucidum (kot so npr. palmitinska, linolna, oleinska in stearinska kislina) bolj topne pri višjih temperaturah. Višji izkoristek beležimo pri hladni ekstrakciji z EtOH, kar kaže na to, da nekatere spojine pri višjih temperaturah razpadejo (npr. triterpeni za katere so priporočljive ekstrakcijske temperature pod 80 C, kar je ravno na meji temperature vrelišča EtOH, ki je 79 C). 4.1.3 Kemijske analize trosnjakov 4.1.3.1 Določanje vsebnosti skupnih fenolov v organskih ekstraktih Rezultate vsebnosti skupnih fenolov v ekstraktih trosnjakov smo podali kot mg galne kisline na gram ekstrakta (mg GAg ekstrakta ± SD). Slika 4-3 prikazuje vsebnost skupnih fenolov v gramu organskih ekstraktov pridobljenih s postopkom vroče in hladne ekstrakcije iz trosnjakov ob uporabi izbranih organskih topil. 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 Slika 4-3: Vsebnost skupnih fenolov v gramu ekstrakta (mg GAg ekstrakta ± SD) pridobljenega z vročo (v) ali hladno (h) ekstrakcijo trosnjakov (T) ob uporabi različnih organskih topil (metanol (MeOH), etanol (EtOH), aceton (AcOH) in heksan (Hex) Največjo vsebnost skupnih fenolov v gramu ekstrakta beležimo pri uporabi EtOH (slika 4-3). Vsebnost skupnih fenolov po vroči ekstrakciji trosnjakov z EtOH (T-v-EtOH) znaša 74,4 mg GA g ekstrakta, medtem, ko je po hladni ekstrakciji trosnjakov (T-h-EtOH) vsebnost skupnih fenolov nekoliko nižja in znaša 65,72 mg GA g ekstrakta. Visoko vsebnost skupnih fenolov ima tudi ekstrakt pridobljen s postopkom hladne ekstrakcije ob uporabi MeOH in znaša 52,11 mg GA g ekstrakta. Nižje vsebnosti skupnih fenolov so v ekstraktih pridobljenih z AcOH in Hex. Izkaže se, da temperatura pri kateri je potekala ekstrakcija nima večjega vpliva na vsebnost skupnih fenolov. Številne študije so pokazale, da sta MeOH in EtOH najbolj učinkovita za pridobivanje polifenolov iz izbranih zdravilnih rastlin (Sultana in sod., 2009). Strukturno poznamo različne fenole (vse od enostavnih fenolov, fenolnih kislin, ter 32

flavnoidov, ligninov, melaninov, itd.), ki pri višjih temperaturah začnejo razpadati, zato so optimalne ekstrakcijske temperature med 40 in 60 C. 4.1.3.2 Določanje skupnega sladkorja v ekstraktih bogatih s polisaharidi Pri gobah je značilno, da polisaharidi pogosto tvorijo komplekse z OH in fenoli, zato postopki za njihovo pridobivanje vsebujejo ekstrakcijo z MeOH, nato še z vročo H 2 O in številne postopke čiščenja, ter naposled še končno obarjanje z EtOH. Ekstrakte polisaharidov iz trosnjakov G. lucidum smo pridobili najprej z pred- ekstrakcijo materiala z MeOH, nato smo material ekstrahirali z vročo H 2 O, da smo dobili čisto vodno raztopino (čv). Naprej so sledili trije različni postopki obarjanja samih polisaharidov iz čv: (i) obarjanje z 20% trifluoroocetno kislino (T čv), (ii) obarjanje z EtOH v razmerju 3:1 (T EtOH 3:1), ter (iii) ekstrakcija z 2% NaOH in obarjanje s 20 % trifluoroocetno kislino (T psc). Rezultate vsebnosti sladkorja v ekstraktih bogatih s polisaharidih smo podali kot mg glukoze na g ekstrakta (mg GLCg ekstrakta ± SD), in so prikazani na sliki 4-4. 30 Vsebnost sladkorjev mg GLC g ekstrakta 25 20 15 10 5 0 T- čv T-psc T-p- EtOH 3:1 Slika 4-4: Vsebnost sladkorja (mg GLCg ekstrakta ± SD) v ekstraktih bogatih s polisaharidi pridobljenih po ekstrakciji trosnjakov (T) z različnimi postopki: T-čv čisti vodni; T-psc, ki smo ga pred obarjanjem z 20% trifloroocetno kislino kuhali v 2% NaOH, 3 ure in T-p- EtOH 3:1, kjer smo po kuhanju z 2% NaOH in obarjanju z 20% trifluoroocetno kislino raztopini dodali EtOH v razmerju 3:1 Iz rezultatov je razvidno, da se količina skupnih sladkorjev bistveno ne razlikuje glede na uporabljen postopek ekstrakcije za njihovo pridobivanje. Največjo količino sladkorja smo izmerili pri polisaharidih z EtOH v razmerju 3:1 in sicer 15,9 mgg. Vsebnost sladkorjev je nekoliko manjša pri ekstraktu, ki je pridobljen samo z vročo ekstrakcijo z vodo in znaša 14,3 mgg. Najnižjo vrednost sladkorjev zabeležimo v ekstraktu (psc) katerega smo pred obarjanjem z trifluoroocetno kislino kuhali v 2% NaOH in znaša 13,3 mgg sladkorja. 33

Vsebnost skupnih fenolov mg GA ek. g ek. % Ekstrakcija biološko aktivnih spojin iz Ganoderme lucidum ob uporabi organskih topil in Pri ekstrakciji polisaharidov smo najprej z uporabo MeOH odstranili fenolne spojine. Z uporabo H 2 O in 2% NaOH smo ekstrahirali vodotopne polisaharide in pri tem skušali odstraniti čim več v vodi netopnih polisaharidov. Ker se v takih ekstraktih še vedno nahajajo proteini smo še dodatno obarjali z 20% trifluoroocetno kislino. Da bi dobili čim bolj čiste polisaharide je sledilo še obarjanje z EtOH. Pri tem smo ugotovili, da obarjanje z kislino in EtOH poveča vsebnost polisaharidov in so ti nedvomno bolj čisti. 4.1.3.3 Določanje vsebnosti skupnih fenolov v ekstraktih bogatih s polisaharidi Vsebnost skupnih fenolov smo določali tudi v ekstraktih bogatih s polisaharidi pridobljenih iz trosnjakov G. lucidum ob uporabi različnih metod obarjanja po osnovni ekstrakciji. Rezultati so prikazani na sliki 4-5, ter so podani kot mg galne kisline na gram ekstrakta (mg GA g ekstrakta ± SD). 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 T- čv T- psc T- p -EtOH 3:1 Slika 4-5: Vsebnost skupnih fenolov v gramu ekstrakta bogatega z polisaharidi (mg GAg ekstrakta ± SD) po ekstrakciji trosnjakov (T) z različnimi postopki: T-čv čisti vodni; T-psc, ki smo ga pred obarjanjem z 20% trifloroocetno kislino kuhali v 2% NaOH, 3 ure in in T-p- EtOH 3:1, kjer smo po kuhanju z 2% NaOH in obarjanju z 20% trifluoroocetno kislino raztopini dodali EtOH v razmerju 3:1. Največjo vsebnost skupnih fenolov je vseboval ekstrakt T-psc in sicer 53,2 mg GA g ekstrakta. Za polovico nižje vrednosti fenolov smo zabeležili v ekstraktu T-čv 24,3 mg GA g ekstrakta, medtem, ko je vsebnost fenolov v ekstraktu T-p-EtOH 3:1 bila najmanjša in je znašala 4,2 mg GA g ekstrakta. Rezultati kažejo, da obarjanje z 20% trifluoroocetno kislino in EtOH skoraj popolnoma odstranita fenole iz polisaharidnih ekstraktov. Pridobivanje ekstraktov bogatih izključno s polisaharidi je pomembno za določanje biološke aktivnosti. 4.1.3.4 Določanje vsebnosti proteinov z Bradfordovo metodo Visoka vsebnost proteinov je pomembna za celično delovanje in regeneracijo tkiv. Ekstrakte bogate s proteini iz trosnjakov G. lucidum smo pridobili najprej z predekstrakcijo materiala z MeOH, nato smo material ekstrahirali z vročo H 2 O, da smo dobili 34

Vsebnost skupnih beljakovin W ek. mgg Ekstrakcija biološko aktivnih spojin iz Ganoderme lucidum ob uporabi organskih topil in čisto vodno raztopino (čv), ter proteine oborili z dodatkom 20% trifluoroocetne kisline. V ekstraktih bogatih s proteini smo določali skupno vsebnost proteinov, ter rezultate podali kot mg beljakovin na gram ekstrakta (mg BSA g ekstrakta ± SD), kar prikazuje slika 4-6. 20 18 16 14 12 10 8 6 4 2 0 T proteini Slika 4-6: Vsebnost skupnih proteinov za trosnjake mg BSAg ekstrakta ± SD Količina skupnih proteinov v ekstraktih iz trosnjakov je bila 3,1 mgg, kar je bistveno manj, kot so jih v svoji raziskavi določili Usman in sod. (2012). Proteini gob pogosto nastopajo v kompleksih z β-d-glukani ali fenoli, zato je koncentracija prostih proteinov nizka. 4.1.3.5 Določanje vsebnosti skupnih fenolov v ekstraktih bogatih s proteini Proteini gob pogosto tvorijo komplekse s fenolnimi spojinami. Tako smo po obarjanju z 20% trifluoroocetno kislino določili vsebnost skupnih fenolov v ekstraktih bogatih s proteini iz trosnjakov G. lucidum kar je prikazano na sliki 4-7. Rezultati so prikazani kot mg galne kisline na gram ekstrakta (mg GA g ekstrakta ± SD). 35

Vsebnost skupnih fenolov mg GA ek. g ek. % Ekstrakcija biološko aktivnih spojin iz Ganoderme lucidum ob uporabi organskih topil in 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 T - p Slika 4-7: Vsebnost skupnih fenolov v gramu ekstrakta bogatega z proteini (mg GAg ekstrakta ± SD) Količina skupnih fenolov v ekstraktih bogatih s proteini je znašala 61 mg GA g ekstrakta. Rezultati so pokazali presenetljivo velike količine fenolov, kar kaže na prisotnost kompleksov fenolov z proteini, kar sta opazila v svoji raziskavi že Wei in Griensven (2008). 4.1.4 Biološke aktivnosti trosnjakov 4.1.4.1 Določanje antioksidativne aktivnosti organskih ekstraktov z radikalsko metodo DPPH Antioksidativno aktivnost organskih ekstraktov pridobljenih iz trosnjakov G. lucidum smo podali kot odstotek zaviranja (% zaviranja) DPPH glede na slepi vzorec, ki je brez dodanega ekstrakta, kar je prikazano na sliki 4-8. 36

T- h -EtOH T- v- EtOH T- h- AcOH T- v- AcOH T- h- hex T- v- hex T- h- MeOH T- v- MeOH Zaviranje radikala DPPH (%) Ekstrakcija biološko aktivnih spojin iz Ganoderme lucidum ob uporabi organskih topil in 50 45 40 35 30 25 20 15 10 5 0 Slika 4-8: Odstotek zaviranja radikala DPPH (% ± SD) po dodatku ekstrakta pridobljenega po vroči (v) ali hladni (h) ekstrakciji trosnjakov (T) ob uporabi različnih organskih topil (metanol (MeOH), etanol (EtOH), aceton (AcOH) in heksan (Hex) Iz slike 4-8 je razvidno, da je največji odstotek zaviranja radikala DPPH po dodatku ekstrakta pridobljenega pri vroči ekstrakciji z AcOH (T-v-AcOH) in znaša (23,7 %). Odstotek zaviranja radikala DPPH po dodatku ekstraktov iz trosnjakov si nato sledijo v padajočem vrstnem redu: T-v-EtOH (17,3 %), T-v-MeOH (15,6 %) in T-v-Hex (0,7 %). Iz rezultatov je razvidno, da temperatura (v vs. h) pri procesu ekstrakcije bistveno ne vpliva na antioksidativno aktivnost ekstraktov, razen v primeru uporabe AcOH. Rezultati so namreč pokazali za 8% boljši odstotek zaviranja radikala DPPH po dodatku ekstrakta dobljenega z vročo ekstrakcijo (T-v-AcOH) v primerjavi z hladno ekstrakcijo (T-h-AcOH). Najnižji odstotek zaviranja radikala DPPH smo zaznali po dodatku Hex ekstrakta (v in h), kar pomeni, da maščobne kisline niso tako močni antioksidanti kot nekatere fenolne spojine. Antioksidativna aktivnost organskih ekstraktov sovpada z vsebnostjo skupnih fenolov. Večja kot je vsebnost fenolov v samem ekstraktu večja je antioksidativna aktivnost, kar sta opazila tudi Wei in Griensven (2008). 4.1.4.2 Določanje antioksidativne aktivnosti ekstraktov bogatih s polisaharidi z radikalsko metodo DPPH Antioksidativno aktivnost ekstraktov bogatih s polisaharidi pridobljenih iz trosnjakov G. lucidum smo podali kot odstotek zaviranja (% zaviranja ± SD) DPPH glede na slepi vzorec, ki je brez dodanega ekstrakta. Rezultati so prikazani na sliki 4-9. 37

Zaviranje radikala DPPH (%) Ekstrakcija biološko aktivnih spojin iz Ganoderme lucidum ob uporabi organskih topil in 50 45 40 35 30 25 20 15 10 5 0 T- čv T- psc T- p -EtOH 3:1 Slika 4-9: Odstotek zaviranja radikala DPPH (% ± SD) po dodatku ekstrakta bogatega z polisaharidi pridobljenih po ekstrakciji trosnjakov (T) z različnimi postopki: T-čv čisti vodni; T-psc, ki smo ga pred obarjanjem z 20% trifloroocetno kislino kuhali v 2% NaOH, 3 ure; in T-p- EtOH 3:1, kjer smo po kuhanju z 2% NaOH in obarjanju z 20% trifluoroocetno kislino raztopini dodali EtOH v razmerju 3:1 Iz slike 4-9 je razvidno, da ekstrakt pridobljen z metodo pri kateri smo polisaharide pred obarjanjem kuhali 3 ure v 2% NaOH kaže največji odstotek zaviranja radikala DPPH in sicer (T-psc 20,4%). Nizke aktivnosti zaviranja radikala DPPH smo zabeležili po dodatku ekstraktov pridobljenih z drugima metodama precipitacije polisaharidov z TFA in EtOH. Čisti vodni ekstrakt vsebuje še številne druge spojine, predvsem fenole in zaradi tega je odstotek zaviranja radikala DPPH največji. Rezultati potrjujejo, da so predvsem fenoli iz G. lucidum močni antioksidanti. Izmerjena antioksidativna aktivnost namreč sovpada z količino skupnih fenolov v ekstraktih bogatih s polisaharidi (slika 4-5). 4.1.4.3 Določanje antioksidativne aktivnosti ekstraktov bogatih s proteini z radikalsko metodo DPPH Antioksidativno aktivnost ekstraktov bogatih s proteini pridobljenih iz trosnjakov G. lucidum smo podali kot odstotek zaviranja (% zaviranja ± SD) DPPH glede na slepi vzorec, ki je brez dodanega ekstrakta. Rezultati so prikazani na sliki 4-10. 38

0I I T-v- MeOH T-h- MeOH T-v- EtOH T-h- EtOH T-h- AcOH T-v- AcOH T-h- Hex T-v- Hex Zaviranje encima AChE ( %) Zaviranje radikala DPPH (%) Ekstrakcija biološko aktivnih spojin iz Ganoderme lucidum ob uporabi organskih topil in 50 45 40 35 30 25 20 15 10 5 0 T - p Slika 4-10: Odstotek zaviranja radikala DPPH (% ± SD) po dodatku ekstrakta bogatega z proteini Iz slike 4-10 je razvidno, da ekstrakt bogat s proteini kaže (17,7%) zaviranje radikala DPPH. Ker so analize vsebnosti skupnih fenolov (slika 4-7) v ekstraktu pokazale velike vsebnosti le teh je možno, da so fenoli odgovorni za zmerjeno razmeroma dobro antioksidativno aktivnost. Vsebnost proteinov je bila razmeroma mala. 4.1.4.4 Zaviranje acetilholinesteraze (AChE) z organskimi ekstrakti Rezultati zaviranja encima AChE po dodatku organskih ekstraktov iz trosnjakov pridobljenih s postopkom vroče in hladne ekstrakcije so predstavljeni na sliki 4-11. Testne koncentracije posameznih ekstraktov so bile 1 mgml. V testu smo uporabili tudi znan inhibitor (I) kot pozitivno kontrolo. Rezultate smo podali kot odstotek zaviranja (%) encima AChE ± SD. 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 39

Zaviranje encima AChE (%) Ekstrakcija biološko aktivnih spojin iz Ganoderme lucidum ob uporabi organskih topil in Slika 4-11: Odstotek zaviranja encima AChE (% ± SD) po dodatku ekstrakta pridobljenega po vroči (v) ali hladni (h) ekstrakciji trosnjakov (T) ob uporabi različnih organskih topil (metanol (MeOH), etanol (EtOH), aceton (AcOH) in heksan (Hex) Rezultati testa so pokazali, da ekstrakti zavirajo delovanje encima AChE med 18 in 32 %. Večjih razlik med ekstrakti na zaviranje encima AChE nismo zabeležili. Prav tako nismo zabeležili vpliva temperature ekstrakcije z izbranimi organskimi topili na sposobnost zaviranja encima AChE. Iz tega lahko sklepamo, da trosnjaki G. lucidum vsebujejo tako polarne kot nepolarne spojine, katerih sposobnost zaviranja encima AChE ni močna, a prisotna. 4.1.4.5 Zaviranje acetilholinesteraze (AChE) z ekstrakti bogatimi s polisaharidi Rezultati zaviranja encima AChE po dodatku ekstraktv bogatih s polisaharidi iz trosnjakov pridobljenih z različnimi postopki čiščenja so predstavljeni na sliki 4-12. Testne koncentracije posameznih ekstraktov so bile 1 mgml. V testu smo uporabili tudi znan inhibitor (I) kot pozitivno kontrolo. Rezultate smo podali kot odstotek zaviranja (%) encima AChE ± SD. 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 0I I T - čv T -psc T -p EtOH 3:1 Slika 4-12: Odstotek zaviranja encima AChE (% ± SD) po dodatku ekstrakta bogatega z polisaharidi pridobljenih po ekstrakciji trosnjakov (T) z različnimi postopki: T-čv čisti vodni; T-psc, ki smo ga pred obarjanjem z 20% trifloroocetno kislino kuhali v 2% NaOH, 3 ure in T-p- EtOH 3:1, kjer smo po kuhanju z 2% NaOH in obarjanju z 20% trifluoroocetno kislino raztopini dodali EtOH v razmerju 3:1. Rezultati testa so pokazali, da ekstrakti zavirajo delovanje encima AChE med 15 in 26 %. Največjo razliko smo zabeležili med ekstraktoma T-čv in T-psc, kjer je aktivnost slednjega bila relativno nizka. Iz tega lahko sklepamo, da smo s postopkom čiščenja odstranili večino fenolnih spojin in njihovih kompleksov, ki so opisani zaviralci encima AChE (Hasant in sod., 2013). 40

Zaviranje encima AChE (%) Ekstrakcija biološko aktivnih spojin iz Ganoderme lucidum ob uporabi organskih topil in 4.1.4.6 Zaviranje acetilholinesteraze (AChE) z ekstrakti bogatimi s proteini Rezultati zaviranja encima AChE po dodatku ekstraktov bogatih s proteini iz trosnjakov so predstavljeni na sliki 4-13. Testne koncentracije posameznih ekstraktov so bile 1 mgml. V testu smo uporabili tudi znan inhibitor (I) kot pozitivno kontrolo. Rezultate smo podali kot odstotek zaviranja (%) encima AChE ± SD. 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 0I I T - p Slika 4-13: Odstotek zaviranja encima AChE (% ± SD) po dodatku ekstrakta bogatega z proteini Rezultati so pokazali, da proteini zavirajo delovanje encima AChE in sicer 26%. Ker so analize vsebnosti skupnih fenolov (slika 4-7) v ekstraktu pokazale visoke vsebnosti le teh je možno, da so fenoli odgovorni za razmeroma dobro sposobnost zaviranja AChE. Vsebnost proteinov je bila razmeroma mala. 41

4.2 Primodiji 4.2.1 Sejalna analiza Tabela 4-4: Meritve in izračuni pri sejalni analizi zmletih primodijev št.sit Velikost zanke d (mm) Razpon frakcije (mm) Interval d zanke (mm) PRIMODIJI m= 8 g Masa frakcije Gi (g) Ri (%) Σ(Ri +Ri+1) (%) Srednja velikost d (mm) R (%) R d zanke (%mm) 1 4,00 nad 4 ~ 0,65 9,29 9,29 ~ ~ ~ 2 3,15 3.15-4.0 0,85 1,56 22,29 31,57 3,58 22,29 26,22 3 2,50 2.5-3.15 0,65 1,12 16,00 47,57 2,83 16,00 24,62 4 2,00 2.0-2.5 0,50 0,79 11,29 58,86 2,25 11,29 22,57 5 1,60 1.6-2.0 0,40 0,79 11,29 70,14 1,8 11,29 28,21 6 1,00 1.0-1.6 0,60 0,64 9,14 79,29 1,3 9,14 15,24 7 0,80 0.8-1.0 0,20 0,32 4,57 83,86 0,9 4,57 22,86 8 0,63 0.63-0.80 0,17 0,29 4,14 88,00 0,72 4,14 24,37 9 Dno ~ 0,84 12,00 100,00 ~ ~ ~ 10 11 12 Vsota frakcij 7,00 100,0 Mediansko zrno lahko odčitamo z integralne krivulje porazdelitve mas (slika 4-14) pri R = 50 % in znaša 2,4 mm. Prav tako lahko iz te krivulje odčitamo podatke za izračun koeficienta enakomerne zrnatosti: k = d(r 25) d(r 75 ) = 3,4 1,22 = 2,787, kar pomeni, da je zrnatost neenakomerna, saj je k > 1,5 42

Diferencialna porazdelitev mas Rsred.d (%mm) Integralna porazdelitev mas R(%) Ekstrakcija biološko aktivnih spojin iz Ganoderme lucidum ob uporabi organskih topil in 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 0,0 1,0 2,0 3,0 4,0 5,0 Velikost zrn (mm) Slika 4-14: Krivulja integralne porazdelitve mas zmletih primodijev 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 0,85 0,65 0,50 0,40 0,60 0,20 0,17 Srednja velikost zrn (mm) Slika 4-15: Krivulja diferencialne porazdelitve mas zmletih primodijev 43

Maksimum diferencialne krivulje porazdelitve mas nam predstavlja najpogosteje zastopano zrno. V primeru zmletih primodijev je to zrno velikosti 0,40 mm. V tabeli 4-5 smo zbrali rezultate sejalne analize za zmlete primodije Tabela 4-5: Rezultati sejalne analize za primodije Mediansko zrno [mm] Najpogosteje zastopano zrno [mm] Koeficient zrnatosti Enakomerna neenakomerna zrnatost 2,4 0,40 2,787 neenakomerna 4.2.2 Konvencionalna ekstrakcija primodijev G. lucidum z organskimi topili Izvedli smo vročo (v) in hladno (h) konvencionalno ekstrakcijo primodijev (P), pri katerih smo uporabili naslednja topila: metanol (MeOH), etanol (EtOH), aceton (AcOH) in heksan (Hex). Po končanih ekstrakcijah smo izračunali izkoristek (η) in rezultati so prikazani v tabeli 4-6. Iz tabele 4-6 je razvidno, da smo največji izkoristek prav tako dobili pri ekstrakciji z MeOH (η = 18,04 %), sledijo AcOH (η = 8,8 %), EtOH (η = 6,15 %) in Hex (η = 3,1 %). Vpliv temperature beležimo pri topilu Hex, kjer ekstrakcija z vročim topilom poviša izkoristek za 2%. V primeru AcOH je izkoristek za 2 % višji pri uporabi hladnega topila. Tabela 4-6: Izkoristek vroče (v) in hladne (h) ekstrakcije (η v %) primodijev (P) ob uporabi različnih organskih topil: metanol (MeOH), etanol (EtOH), aceton (AcOH) in heksan (Hex). Topilo vroča oz. hladna ekstrakcija Izkoristek (η[%]) P-h- MeOH 18,4 P-v- MeOH 14,97 P-h- EtOH 4,94 P-v- EtOH 6,15 P-h- AcOH 8,8 P-v- AcOH 6,5 P-h- Hex 0,95 P-v- Hex 3,1 Iz tabele 4-6 je razvidno, da na izkoristek ekstrakcije vpliva polarnost topila, kjer beležimo največji izkoristek pri najbolj polarnem topilu. Sledijo AcOH, EtOH in Hex. Zaključujemo, da je velik odstotek (%) spojin v primodijih polarne narave. Ekstrakcije z MeOH veljajo predvsem za ekstrakcijo fenolnih spojin, monosaharidov, aminokislin in drugih sorodnih spojin. Hex je med izbranimi topili nepolaren in se uporablja predvsem za pridobivanje maščobnih kislin. Pri uporabi Hex kot topila beležimo najmanjši izkoristek, kar sovpada z 44

P- h EtOH P- v- EtOH P- h- AcOH P- v- AcOH P- h- hex P- v- hex P- h- MeOH P- v- MeOH Vsebnost skupnih fenolov mg GA ex. g ex. % Ekstrakcija biološko aktivnih spojin iz Ganoderme lucidum ob uporabi organskih topil in nizkim deležem maščobnih kislin v gobi G. lucidum. Izkoristek v primeru Hex je višji glede na vročo ekstrakcijo, kar sovpada s tem da so maščobne kisline G. lucidum (kot so npr. palmitinska, linolna, oleinska in stearinska kislina) bolj topne pri višjih temperaturah. Prav tako beležimo višji izkoristek pri hladni ekstrakciji z AcOH, kar kaže na to, da nekatere spojine pri višjih temperaturah razpadejo (npr. triterpeni za katere so priporočljive ekstrakcijske temperature med 60 in 80 C). 4.2.3 Kemijske analize primodijev 4.2.3.1 Določanje vsebnosti skupnih fenolov v organskih ekstraktih Rezultate vsebnosti skupnih fenolov v ekstraktih primodijev smo podali kot mg galne kisline na gram ekstrakta (mg GAg ekstrakta ± SD). Slika 4-16 prikazuje vsebnost skupnih fenolov v gramu organskih ekstraktov pridobljenih s postopkom vroče in hladne ekstrakcije iz primodijev ob uporabi izbranih organskih topil. 120 100 80 60 40 20 0 Slika 4-16: Vsebnost skupnih fenolov v gramu ekstrakta (mg GAg ekstrakta ± SD) pridobljenega z vročo (v) ali hladno (h) ekstrakcijo primodijev (P) ob uporabi različnih organskih topil: metanol (MeOH), etanol (EtOH), aceton (AcOH) in heksan (Hex). Največjo vsebnost skupnih fenolov v gramu ekstrakta beležimo pri uporabi AcOH (slika 4-16). Vsebnost skupnih fenolov po vroči ekstrakciji primodijev z AcOH (P-v-AcOH) znaša 103,3 mg GA g ekstrakta, medtem ko je po hladni ekstrakciji primodijev (P-h-AcOH) vsebnost skupnih fenolov nekoliko nižja in znaša 64,5 mg GA g ekstrakta. Visoko vsebnost skupnih fenolov imata tudi ekstrakta pridobljena z postopkom vroče in hladne ekstrakcije z EtOH in znašata 89,2 mg GA g ekstrakta za vročo in 80 mg GA g ekstrakta za hladno ekstrakcijo. Pri ekstrakcijah z Hex fenolov v ekstraktih ni prisotnih, kar sovpada z teorijo, da sta MeOH in EtOH, ter v našem primeru tudi AcOH (Sultana in sod., 2009) najbolj primerna topila za ekstrakcijo fenolov, medtem, ko se Hex uporablja večinoma za pridobivanje maščobnih kislin. Strukturno poznamo različne fenole (vse od enostavnih fenolov, fenolnih kislin, ter 45

Vsebnost sladkorjev mg GLC g ekstrakta Ekstrakcija biološko aktivnih spojin iz Ganoderme lucidum ob uporabi organskih topil in flavnoidov, ligninov, melaninov, itd.), ki pri višjih temperaturah začnejo razpadati, zato so optimalne ekstrakcijske temperature med 40 in 60 C. 4.2.3.2 Določanje skupnega sladkorja v ekstraktih bogatih s polisaharidi Pri gobah je značilno, da polisaharidi pogosto tvorijo komplekse z fenoli, zato postopki za njihovo pridobivanje vsebujejo ekstrakcijo z MeOH, nato še z vročo H 2 O in številne postopke čiščenja, ter naposled končno obarjanje z EtOH. Ekstrakte polisaharidov iz primodijev G. lucidum smo pridobili najprej z pred- ekstrakcijo materiala z MeOH, nato smo material ekstrahirali z vročo H 2 O, da smo dobili čisto vodno raztopino (čv). Naprej so sledili trije različni postopki obarjanja samih polisaharidov iz čv: (i) obarjanje z 20% trifluoroocetno kislino (P čv), (ii) obarjanje z EtOH v razmerju 3:1 (P EtOH 3:1), ter (iii) ekstrakcija z 2% NaOH in obarjanje s trifluoroocetno kislino (P psc). Rezultate vsebnosti sladkorja v ekstraktih bogatih s polisaharidi smo podali kot mg glukoze na g ekstrakta (mg GLCg ekstrakta ± SD), in so prikazani na sliki 4-17. 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 P-čv P- psc P-p- EtOH 3:1 Slika 4-17: Vsebnost sladkorja (mg GLCg ekstrakta ± SD) v ekstraktih bogatih s polisaharidi pridobljenih po ekstrakciji primodijev (P) z različnimi postopki: P-čv čisti vodni; P-psc, ki smo ga pred obarjanjem kuhali v 2% NaOH, 3 ure in P-p- EtOH 3:1, kjer smo po kuhanju z 2% NaOH in obarjanju z 20% trifluoroocetno kislino raztopini dodali EtOH v razmerju 3:1 Iz rezultatov je razvidno, da smo največjo količino sladkorja izmerili pri polisharidih, ki smo jih dobili z obarjanjem čiste vodne raztopine in znaša 72,7 mg GLC g ekstrakta. Količina sladkorja pri polisaharidih (P psc) in polisaharidih zmešanih z etanolom v razmerju 3:1 je bistveno manjša in se giblje okoli 16 mg GLC g ekstrakta. Vsebnost polisaharidov iz čiste vodne raztopine je nekoliko višja tudi zato, ker jih nismo ekstrahirali z 2% NaOH, ki služi za odstranjevanje nekaterih v vodi netopnih polisaharidov. 46

Vsebnost skupnih fenolov mg GA ek. g ek. % Ekstrakcija biološko aktivnih spojin iz Ganoderme lucidum ob uporabi organskih topil in 4.2.3.3 Določanje vsebnosti skupnih fenolov v ekstraktih bogatih s polisaharidi Vsebnost skupnih fenolov smo določali tudi v ekstraktih bogatih s polisaharidi pridobljenih iz primodijev G. lucidum ob uporabi različnih metod obarjanja po osnovni ekstrakciji. Rezultati so prikazani na sliki 4-18, ter so podani kot mg galne kisline na gram ekstrakta (mg GA g ekstrakta ± SD). 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 P- čv P- psc P- p- EtOH 3:1 Slika 4-18: Vsebnost skupnih fenolov v gramu ekstrakta bogatega z polisaharidi (mg GAg ekstrakta ± SD) po ekstrakciji primodijev (P) z različnimi postopki: P-čv čisti vodni; P-psc, ki smo ga pred obarjanjem kuhali v 2% NaOH, 3 ure in P-p- EtOH 3:1, kjer smo po kuhanju z 2% NaOH in obarjanju z 20% trifluoroocetno kislino raztopini dodali EtOH v razmerju 3:1. Največjo vsebnost skupnih fenolov je imel ekstrakt P-čv in sicer 47 mg GA g ekstrakta. Za skoraj več kot tri krat nižje vrednosti skupnih fenolov smo določili v ekstraktu P-psc 13,4 mg GA g ekstrakta, medtem ko je vsebnost skupnih fenolov v ekstraktu P-p-EtOH 3:1 bila najmanjša in je znašala 6,13 mg GA g ekstrakta. Naši rezultati sovpadajo z teorijo, da bolj kot so ekstrakti čistijo z različnimi postopki manj skupnih fenolov dobimo. Pridobivanje ekstraktov bogatih izključno s polisaharidi je pomembno za določanje biološke aktivnosti. 4.2.3.4 Določanje vsebnosti proteinov z Bradfordovo metodo V ekstraktih bogatih s proteini smo določali skupno vsebnost proteinov, ter rezultate podali kot mg beljakovin na gram ekstrakta (mg BSA g ekstrakta ± SD), kar prikazuje slika 4-19. 47

Vsebnost skupnih fenolov mg GA ek. g ek. % Vsebnost skupnih beljakovin W ek. mgg Ekstrakcija biološko aktivnih spojin iz Ganoderme lucidum ob uporabi organskih topil in 35 30 25 20 15 10 5 0 P proteini Slika 4-19: Vsebnost skupnih proteinov za primodije mg BSAgekstrakta ± SD Količina skupnih proteinov v primodijih je znašala 16,1 mgg. 4.2.3.5 Določanje vsebnosti skupnih fenolov v ekstraktih bogatih s proteini Ekstrakte bogate s proteini iz primodijev G. lucidum smo pridobili najprej z predekstrakcijo materiala z MeOH, nato smo material ekstrahirali z vročo H 2 O, da smo dobili čisto vodno raztopino (čv), ter proteine oborili z dodatkom 20% trifloroocetne kisline. Določili smo vsebnost skupnih fenolov v ekstraktih bogatih s proteini iz primodijev G. lucidum kar je prikazano na sliki 4-20. Rezultati so prikazani kot mg galne kisline na gram ekstrakta (mg GA g ekstrakta ± SD). 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 P - p Slika 4-20: Vsebnost skupnih fenolov v gramu ekstrakta bogatega z proteini (mg GAg ekstrakta ± SD). Količina skupnih fenolov v ekstraktih bogatih s proteini je znašala 26 mg GA g ekstrakta. 48

P- h EtOH P- v- EtOH P- h- AcOH P- v- AcOH P- h- hex P- v- hex P- h- MeOH P- v- MeOH Zaviranje radikala DPPH (%) Ekstrakcija biološko aktivnih spojin iz Ganoderme lucidum ob uporabi organskih topil in 4.2.4 Biološke aktivnosti primodijev 4.2.4.1 Določanje antioksidativne aktivnosti organskih ekstraktov z radikalsko metodo DPPH Antioksidativno aktivnost organskih ekstraktov pridobljenih iz primodijev G. lucidum smo podali kot odstotek zaviranja (% zaviranja) DPPH glede na slepi vzorec, ki je brez dodanega ekstrakta, kar je prikazano na sliki 4-21. 60 50 40 30 20 10 0 Slika 4-21: Odstotek zaviranja radikala DPPH (% ± SD) po dodatku ekstrakta pridobljenega po vroči (v) ali hladni (h) ekstrakciji primodijev (P) ob uporabi različnih organskih topil: metanol (MeOH), etanol (EtOH), aceton (AcOH) in heksan (Hex). Iz slike 4-21 je razvidno, da je največji odstotek zaviranja radikala DPPH po dodatku ekstrakta pridobljenega pri vroči ekstrakciji z AcOH (P-v-AcOH) in znaša (54,6 %). Odstotek zaviranja radikala DPPH po dodatku ekstraktov iz primodijev si nato sledijo v padajočem vrstnem redu: P-v-EtOH (35,1 %), P-v-MeOH (25,9 %) in P-v-Hex (0,0 %). Iz rezultatov je razvidno, da temperatura (v vs. h) pri procesu ekstrakcije bistveno ne vpliva na antioksidativno aktivnost ekstraktov, razen v primeru uporabe AcOH. Rezultati so namreč pokazali za 26% boljši odstotek zaviranja radikala DPPH po dodatku ekstrakta dobljenega z vročo ekstrakcijo (P-v-AcOH) v primerjavi z hladno ekstrakcijo (P-h-AcOH). Pri Hex nismo zaznali zaviranja radikala DPPH, kar pomeni, da maščobne kisline niso tako močni antioksidanti kot nekatere fenolne spojine. Antioksidativna aktivnost organskih ekstraktov močno sovpada z vsebnostjo skupnih fenolov. Večja kot je vsebnost fenolov v samem ekstraktu, večja je antioksidativna aktivnost, kar sta opazila tudi Wei in Griensven (2008). 49

Zaviranje radikala DPPH (%) Ekstrakcija biološko aktivnih spojin iz Ganoderme lucidum ob uporabi organskih topil in 4.2.4.2 Določanje antioksidativne aktivnosti ekstraktov bogatih s polisaharidi z radikalsko metodo DPPH Antioksidativno aktivnost ekstraktov bogatih s polisaharidi pridobljenih iz primodijev G. lucidum smo podali kot odstotek zaviranja (% zaviranja ± SD) DPPH glede na slepi vzorec, ki je brez dodanega ekstrakta. Rezultati so prikazani na sliki 4-22. 50 45 40 35 30 25 20 15 10 5 0 P- čv P- psc P- p- EtOH 3:1 Slika 4-22: Odstotek zaviranja radikala DPPH (% ± SD) po dodatku ekstrakta bogatega z polisaharidi pridobljenih po ekstrakciji primodijev (P) z različnimi postopki: P-čv čisti vodni; P-psc, ki smo ga pred obarjanjem kuhali v 2% NaOH, 3 ure in P-p- EtOH 3:1, kjer smo po kuhanju z 2% NaOH in obarjanju z 20% trifluoroocetno kislino raztopini dodali EtOH v razmerju 3:1 Iz slike 4-22 je razvidno, da ekstrakt pridobljen z obarjanjem čiste vodne raztopine (P-čv) kaže največji odstotek zaviranja radikala DPPH in sicer 8,1 %. Nizke aktivnosti zaviranja radikala DPPH smo zabeležili po dodatku ekstraktov pridobljenih z drugima metodama precipitacije polisaharidov z 20% trifluoroocetno kislino in EtOH. Čisti vodni ekstrakt vsebuje še številne druge spojine, predvsem fenole in zaradi tega je odstotek zaviranja radikala DPPH največji. Rezultati potrjujejo, da so predvsem fenoli iz G. lucidium močni antioksidanti. Izmerjena antioksidativna aktivnost namreč sovpada z količino skupnih fenolov v ekstraktih bogatih s polisaharidi (slika 4-18). 4.2.4.3 Določanje antioksidativne aktivnosti ekstraktov bogatih s proteini z radikalsko metodo DPPH Antioksidativno aktivnost ekstraktov bogatih s proteini pridobljenih iz primodijev G. lucidum smo podali kot odstotek zaviranja (% zaviranja ± SD) DPPH glede na slepi vzorec, ki je brez dodanega ekstrakta. Rezultati so prikazani na sliki 4-23. 50

0I I P-v- MeOH P-h- MeOH P-v- EtOH P-h- EtOH P-h- AcOH P-v- AcOH P-h- Hex P-v- Hex Zaviranje encima AChE (%) Zaviranje radikala DPPH (%) Ekstrakcija biološko aktivnih spojin iz Ganoderme lucidum ob uporabi organskih topil in 50 45 40 35 30 25 20 15 10 5 0 P - p Slika 4-23: Odstotek zaviranja radikala DPPH (% ± SD) po dodatku ekstrakta bogatega z proteini Iz slike 4-23 vidimo, da ekstrakt bogat s proteini kaže (3,4 %) zaviranje radikala DPPH. Ker so analize vsebnosti skupnih fenolov (slika 4-20) v ekstraktu pokazale dokaj velike vsebnosti le teh je možno, da so fenoli odgovorni za zmerjeno antioksidativno aktivnost. Vsebnost proteinov je bila mala. 4.2.4.4 Zaviranje acetilholinesteraze (AChE) z organskimi ekstrakti Rezultati zaviranja encima AChE po dodatku organskih ekstraktov iz primodijev pridobljenih s postopkom vroče in hladne ekstrakcije so predstavljeni na sliki 4-24. Testne koncentracije posameznih ekstraktov so bile 1 mgml. V testu smo uporabili tudi znan inhibitor (I) kot pozitivno kontrolo. Rezultate smo podali kot odstotek zaviranja (%) encima AChE ± SD. 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 51

Zaviranje encima AChE (%) Ekstrakcija biološko aktivnih spojin iz Ganoderme lucidum ob uporabi organskih topil in Slika 4-24: Odstotek zaviranja encima AChE (% ± SD) po dodatku ekstrakta pridobljenega po vroči (v) ali hladni (h) ekstrakciji primodijev (P) ob uporabi različnih organskih topil: metanol (MeOH), etanol (EtOH), aceton (AcOH) in heksan (Hex). Rezultati testa so pokazali, da ekstrakti zavirajo delovanje encima AChE med 12 in 29 %. Večjih razlik med ekstrakti na zaviranje encima AChE nismo zabeležili. Prav tako nismo zabeležili vpliva temperature ekstrakcije z izbranimi organskimi topili na sposobnost zaviranja encima AChE. Iz tega lahko sklepamo, da primodiji vsebujejo tako polarne kot nepolarne spojine, katerih sposobnost zaviranja encima AChE ni močna, a prisotna. 4.2.4.5 Zaviranje acetilholinesteraze (AChE) z ekstrakti bogatimi s polisaharidi Rezultati zaviranja encima AChE po dodatku ekstraktv bogatih s polisaharidi iz primodijev pridobljenih z različnimi postopki čiščenja so predstavljeni na sliki 4-25. Testne koncentracije posameznih ekstraktov so bile 1 mgml. V testu smo uporabili tudi znan inhibitor (I) kot pozitivno kontrolo. Rezultate smo podali kot odstotek zaviranja (%) encima AChE ± SD. 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 0I I P - čv P -psc P -p EtOH 3:1 Slika 4-25: Odstotek zaviranja encima AChE (% ± SD) po dodatku ekstrakta bogatega z polisaharidi pridobljenih po ekstrakciji primodijev (P) z različnimi postopki: P-čv čisti vodni; P-psc, ki smo ga pred obarjanjem kuhali v 2% NaOH, 3 ure in P-p- EtOH 3:1, kjer smo smo po kuhanju z 2% NaOH in obarjanju z 20% trifluoroocetno kislino raztopini dodali EtOH v razmerju 3:1 Rezultati testa so pokazali, da ekstrakti zavirajo delovanje encima AChE med 0,4 in 21 %. Največjo razliko smo zabeležili med ekstraktoma P-čv in P-p-EtOH 3:1, kjer je aktivnost slednjega bila zelo nizka. Iz tega lahko sklepamo, da smo s postopkom čiščenja odstranili večino fenolnih spojin in njihovih kompleksov, ki so opisani zaviralci encima AChE (Hasant in sod., 2013). 52

Zaviranje encima AChE (%) Ekstrakcija biološko aktivnih spojin iz Ganoderme lucidum ob uporabi organskih topil in 4.2.4.6 Zaviranje acetilholinesteraze (AChE) z ekstrakti bogatimi s proteini Rezultati zaviranja encima AChE po dodatku ekstraktov bogatih s proteini iz primodijev so predstavljeni na sliki 4-26. Testne koncentracije posameznih ekstraktov so bile 1 mgml. V testu smo uporabili tudi znan inhibitor (I) kot pozitivno kontrolo. Rezultate smo podali kot odstotek zaviranja (%) encima AChE ± SD. 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 0I I P - p Slika 4-26: Odstotek zaviranja encima AChE (% ± SD) po dodatku ekstrakta bogatega z proteini Rezultati so pokazali da proteini zavirajo delovanje encima AChE in sicer 13%. Ker so analize vsebnosti skupnih fenolov (slika 4-20) v ekstraktu pokazale dokaj velike vsebnosti le teh, je možno, da so fenoli odgovorni za razmeroma dobro sposobnost zaviranja AChE. Vsebnost proteinov je bila razmeroma mala. 4.3 Tankoslojna kromatografija 4.3.1 Določevanje tipa sladkorjev v ekstraktih bogatih s polisaharidi s tankoslojno kromatografijo (TLC) Standardi sladkorji, ki smo jih uporabili za TLC analizo so riboza, D- manoza, fruktoza, galaktoza, arabtoza in ksiloza. Analizirani vzorci, ki so bili vključeni v analizo so: T psc 1-2, Tčv, T EtOH 3:1, P psc 1-2, Pčv in P EtOH 3:1. Slika 4-27 prikazuje dobljene rezultate analize sladkorjev v ekstraktih bogatih s polisaharidi pridobljenih iz trosnjakov in primodijev G. lucidum s TLC. 53

Slika 4-27: Tankoslojna kromatografija sladkorjev v ekstraktih bogatih s polisaharidi pridobljenih iz trosnjakov in primodijev G. lucidium Iz rezultatov je razvidno, da polisaharidi, ki smo jih dobili z obarjanjem čiste vodne raztopine iz trosnjakov in primodijev vsebujejo fruktozo. Pri ostalih so retenzijski faktorji (Rf) večji od standardov, kar pomeni, da ekstrakti vsebujejo še nekatere druge sladkorje. 4.4 Primerjava rezultatov kemijske analize in bioloških aktivnosti ekstraktov pridobljenih iz trosnjakov in primodijev G. lucidium V tabeli 4-7 so prikazani skupni rezultati kemijskih analiz in testiranih bioloških aktivnosti vseh ekstraktov pridobljenih iz trosnjakov (T) G. lucidum z različnimi postopki. Tabela 4-7: Rezultati kemijskih analiz in testiranih bioloških aktivnosti ekstraktov iz trosnjakov (T) G. lucidium. Ekstrakt Totalni fenoli mg GA g Vsebnost sladkorjev Vsebnost proteinov DPPH % Zaviranje AChE % Mg GLC g ekstrakta T-h- MeOH 52,1 15,64 26 T-v- MeOH 32,9 12,87 23 T-h- EtOH 65,7 17,3 24 T-v-EtOH 74,4 16,8 32 T-h-AcOH 26,7 15,4 27 T-v-AcOH 45,0 23,7 18 T-v-Hex 9 0,72 24 T-h-Hex 14,8 0,47 26 54