DANILA BENKO MAGISTRSKA NALOGA ENOVITI MAGISTRSKI ŠTUDIJ FARMACIJE

Transcription

1 DANILA BENKO MAGISTRSKA NALOGA ENOVITI MAGISTRSKI ŠTUDIJ FARMACIJE Ljubljana, 2015

2 DANILA BENKO FARMAKOGENETSKA ANALIZA POLIMORFIZMOV V IZBRANIH GENIH PRI ZDRAVLJENJU Z ZAVIRALCI TESTOSTERON-5- ALFA-REDUKTAZE PHARMACOGENETIC ANALYSIS OF POLYMORPHISMS OF SELECTED GENES IN THERAPY WITH INHIBITORS OF TESTOSTERONE-5-ALPHA-REDUCTASE Magistrska naloga Ljubljana, 2015

3 Magistrsko nalogo sem opravljala na Fakulteti za farmacijo pod mentorstvom prof. dr. Janje Marc, mag. farm., spec. med. biokem. in somentorstvom asist. dr. Simone Mencej Bedrač, mag. farm. Bolniki so bili obravnavani na urološkem oddelku Splošne bolnišnice Celje, genotipizacija vzorcev pa je bila opravljena na Katedri za klinično biokemijo. Zahvaljujem se mentorici prof. dr. Janji Marc, mag. farm., spec. med. biokem. in asist. dr. Simoni Mencej Bedrač, mag. farm. za vse strokovne napotke in pomoč pri nastajanju magistrske naloge. Zahvaljujem se tudi staršem, ki so verjeli vame, me podpirali in spodbujali skozi študijska leta. Prav tako bi se rada zahvalila tudi Anji, Evi, Heleni, Ivi, Jasmini, Katji in Maji za lepa študentska leta, za vse izmenjane zapiske in motivacijo v izpitnih obdobjih. Izjava Izjavljam, da sem izdelala magistrsko nalogo samostojno ob pomoči mentorice prof. dr. Janje Marc, mag. farm., spec. med. biokem. in somentorice asist. dr. Simone Mencej Bedrač, mag. farm. Danila Benko Predsednik komisije: izr. prof. dr. Marko Anderluh, mag. farm. Članica komisije: doc. dr. Alenka Zvonar Pobirk, mag. farm. I

4 VSEBINA POVZETEK... V ABSTRACT... VI SEZNAM OKRAJŠAV... VII SEZNAM SLIK... IX SEZNAM PREGLEDNIC... IX 1. UVOD SINTEZA IN DELOVANJE ANDROGENOV Biosintezna pot steroidnih hormonov Delovanje testosterona in dihidrotestosterona BENIGNA HIPERPLAZIJA PROSTATE Benigna hiperplazija prostate Zdravljenje benigne hiperplazije prostate Genetsko ozadje benigne hiperplazije prostate OSTEOPOROZA PRI MOŠKIH IN KOSTNA PRENOVA Osteoporoza pri moških Kostna prenova in signalna pot RANK/RANKL/OPG Genetsko ozadje signalne poti RANK/RANKL/OPG Vpliv spolnih hormonov na kostno prenovo Vpliv estrogena na kostno prenovo Vpliv androgenov na kostno prenovo POLIMORFIZMI ENCIMOV IZ DRUŽINE CITOKROMOV P Vpliv polimorfizmov na delovanje CYP3A Vpliv polimorfizmov na delovanje CYP3A NAMEN DELA MATERIALI IN METODE OPIS PREISKOVANCEV ALELNA DISKRIMINACIJA Kvantitativna verižna reakcija s polimerazo Potek alelne diskriminacije Izvedba alelne diskriminacije II

5 3.2.1 Določanje polimorfizma 15389C>T v genu za CYP3A Postopek dela in priprava reakcijske zmesi Reakcijski pogoji in potek PCR reakcije Reagenti in aparature Določanje polimorfizma 6986A>G genu za CYP3A Postopek dela in priprava reakcijske zmesi Reakcijski pogoji in potek PCR reakcije Reagenti in aparature Določanje polimorfizmov -290C>T in -643C>T v genu za RANKL ter polimorfizma K3N v genu za OPG Postopek dela in priprava reakcijske zmesi Reakcijski pogoji in potek PCR reakcije Reagenti in aparature STATISTIČNA OBDELAVA PODATKOV REZULTATI IN RAZPRAVA OPTIMIZACIJA POGOJEV qpcr POGOSTNOST POLIMORFIZMOV V SKUPINI BOLNIKOV Z BENIGNO HIPERPLAZIJO PROSTATE OCENA USPEŠNOSTI ZDRAVLJENJA GLEDE NA ZDRAVILNO UČINKOVINO OCENA FARMAKOGENETSKEGA VPLIVA POLIMORFIZMOV 15389C>T V GENU ZA CYP3A4 IN 6986A>G V GENU ZA CYP3A5 NA ZDRAVLJENJE Z ZAVIRALCI 5α-REDUKTAZE OCENA NEŽELENIH UČINKOV ZAVIRALCEV 5α-REDUKTAZE NA KOSTNO PRENOVO OCENA POVEZANOSTI POLIMORFIZMOV V GENIH ZA RANKL IN OPG S KAZALCI KOSTNE PREMENE GLEDE NA ZDRAVILNO UČINKOVINO Ocena povezanosti polimorfizma -290C>T v genu za RANKL s kazalci kostne prenove pri bolnikih z BHP na zdravljenju z zaviralci 5α-reduktaze Ocena povezanosti polimorfizma -643C>T v genu za RANKL s kazalci kostne prenove pri bolnikih z BHP na terapiji z zaviralci 5α-reduktaze Ocena povezanosti polimorfizma K3N v genu za OPG s kazalci kostne prenove pri bolnikih z BHP na terapiji z zaviralci 5α-reduktaze III

6 5. SKLEP LITERATURA PRILOGE OCENA USPEŠNOSTI GLEDE NA ZDRAVILNO UČINKOVINO OCENA USPEŠNOSTI GLEDE GENETSKE SPREMEMBE KORELACIJE REZULTATI GENOTIPIZACIJE POLIMORFIZMA 15389C>T CYP3A REZULTATI GENOTIPIZACIJE POLIMORFIZMA 6986A>G CYP3A REZULTATI GENOTIPIZACIJE POLIMORFIZMA -290C>T RANKL REZULTATI GENOTIPIZACIJE POLIMORFIZMA -643C>T RANKL REZULTATI GENOTIPIZACIJE POLIMORFIZMA K3N OPG IV

7 POVZETEK Benigna hiperplazija prostate (BHP) je kronična in počasi napredujoča bolezen, ki prizadene starejše moške. BHP lahko zdravimo z zaviralci 5α-reduktaze (finasterid, dutasterid), ki zavirajo pretvorbo testosterona v dihidrotestosteron v prostati. Ker učinkovine vplivajo na biosintezno pot spolnih hormonov, ki imajo pomembno vlogo tudi pri patogenezi osteoporoze, smo se odločili, da bomo pri bolnikih z BHP raziskali vpliv zdravljenja z zaviralci 5α-reduktaze in spremenjenih koncentracij spolnih hormonov na kosti in ključni sistem kostne razgradnje RANK/RANKL/OPG. V presnovo finasterida in dutasterida sta vključena citokroma P450 CYP3A4 in CYP3A5, zato smo hoteli preveriti, ali polimorfizmi v teh dveh genih vplivajo na metabolizem obeh učinkovin in na potek zdravljenja. V raziskavo smo vključili 70 bolnikov z BHP. 35 bolnikov se je eno leto zdravilo s finasteridom, 35 pa z dutasteridom. Klinično stanje bolnikov smo ovrednotili pred začetkom zdravljenja ter po 6 in 12 mesecih zdravljenja. S kvantitativno verižno reakcijo s polimerazo smo analizirali 70 vzorcev z izolirano DNA in z alelno diskriminacijo določili genotipe preiskovancev za polimorfizme v genih za CYP3A4, CYP3A5, RANKL in OPG. S statističnimi metodami smo ugotavljali, ali obstaja razlika v učinkovitosti zdravljenja glede na zdravilno učinkovino in ali različni polimorfizmi v genih za CYP3A4 in CYP3A5 vplivajo na zdravljenje. V ta namen smo spremljali koncentracijo dihidrotestosterona, volumen prostate in seštevek točk IPSS vprašalnika. V nadaljevanju smo ugotavljali, ali obstaja povezava med polimorfizmi v genih za RANKL in OPG ter koncentracijami biokemičnih kazalcev kostne premene. Določili smo genotipske frekvence za vseh 5 polimorfizmov, ki so bile v Hardy-Weinbergovem ravnotežju in se niso razlikovale od objavljenih podatkov za kavkazijsko populacijo. S statistično analizo nismo dokazali značilne razlike v učinkovitosti med učinkovinama. Ugotovili smo, da prisotnost polimorfizmov v genu za CYP3A4 in CYP3A5 ne vpliva na potek zdravljenja z zaviralci 5α-reduktaze pri moških z BHP. Zdravljenje z zaviralci 5α-reduktaze delno vpliva na kostno prenovo pri moških in je odvisno od sprememb v genih za RANKL in/ali OPG. Ključne besede: benigna hiperplazija prostate, RANK/RANKL/OPG, CYP3A4, CYP3A5, farmakogenetika V

8 ABSTRACT Benign prostatic hyperplasia (BPH) is a chronic and slowly progressive disease that affects older men. BPH can be treated using 5α-reductase inhibitors (finasteride, dutasteride) which hinder a conversion of testosteron to dihydrotestosterone in the prostate. Since the substances affect the biosinthetic pathway of sex hormones, which also play an important role in the pathogenesis of osteoporosis, we have decided to examine the effect of treatment using 5α-reductase inhibitors and modified concentrations of sex hormones on patient's bone and the key system of bone degradation RANK/RANKL/OPG. Cytochromes P450 CYP3A4 and CYP3A5 are involved in the metabolism of finasteride and dutasteride so we wanted to examine if polymorphisms in these two genes have an affect on the metabolism of both substances and the course of the treatment. The research included 70 patients with BPH. For a year 35 patients were treated with finasteride and 35 with dutasteride. Patient's clinical condition was defined prior to the start of the treatment and then after 6 and 12 months of treatment. Using the quantitative polymerase chain reaction we have analized 70 samples with isolated DNA and using the allele discrimination we have established researchee's genotypes for polymorphisms in the genes for RANKL, OPG, CYP3A4 and CYP3A5. Using statistical methods it has been examined if there is a difference between the effectiveness of the treatment regarding an active substance and if different polymorphisms in the genes for CYP3A4 and CYP3A5 affect the treatment. For this purpose the concentration of dihydrotestosterone, prostate volume, and the score of IPSS questionnaire have been monitored. Furthermore the research has examined if there is a connection between the polymorphisms in the genes for RANKL and OPG and the concentrations of indicators of bone turnover. We determined the genotype frequencies for all 5 polimorphisms that were in Hardy-Weinberg equilibrium and did not differ from published data for Caucasians. Statistical analysis has not demonstrated significant differences in efficacy between the active substance. It has been found that the presence of polymorphisms in the gene for CYP3A4 and CYP3A5 does not effect the course of treatment with inhibitors of 5α-reductase in men with BPH. Treatment with inhibitors of 5α-reductase partially affect the bone turnover in men and depends on changes in the genes of RANKL and/or OPG. Keywords: benign prostatic hyperplasia, RANK/RANKL/OPG, CYP3A4, CYP3A5, pharmacogenetics VI

9 SEZNAM OKRAJŠAV AR Androgeni receptor BHP Benigna hiperplazija prostate CTX C-terminalni telopeptid CYP Citokrom DHT Dihidrotestosteron DNA Deoksiribonukleinska kislina DU Dutasterid E Estrogen EGF Epidermalni rastni faktor (ang. epidermal growth factor) ER Estrogenski receptor FGF Fibroblastni rastni faktor (ang. fibroblast growth factor) FI Finasterid FRET Fluorescenčni resonančni prenos energije IL Interlevkin IGF Inzulinu podoben rastni faktor (ang. insuline-like growth factor) IPSS Mednarodni vprašalnik o simptomih prostate JNK1 N-terminalna kinaza c-jun LUTS Simptomi spodnjega urinarnega trakta (ang. lower urinary tract symptoms) M-CSF Makrofag kolonije stimulirajoči dejavnik (ang. macrophage colony-stimulating factor) MGB (ang. minor groove binding) MKG Mineralna kostna gostota NADPH Nikotinamid dinukleotid fosfat hidrat NFATc1 Jedrni faktor za aktivacijo T celic-1 OC Osteokalcin OPG Osteoprotegerin PSA Za prostato specifični antigen PTH Paratiroidni hormon P1NP N-terminalni propeptid prokolagena 1 RANK Receptor za aktivacijo jedrnega faktorja κb (ang. receptor activator of nuclear factor κb) VII

10 RANKL Ligand za receptor za aktivacijo jedrnega faktorja κb (angl. receptor activator of nuclear factor κb ligand) qpcr Kvantitativna verižna reakcija s polimerazo SAPK S stresom aktivirana protein kinaza (angl. stress-activated protein kinase) SHBG Spolne hormone vezoči globulin SNP Polimorfizem enega nukleotida (angl. single nucleotide polymorphism) T Testosteron TGF-ß Transformirajoči rastni faktor ß (ang. transforming growth factor -ß) TNF Tumorje nekrotizirajoč dejavnik (angl. tumor necrosis factor ) TNFR Receptor za tumorje nekrotizirajoč dejavnik (angl. tumor necrosis factor receptor) TRAF6 (ang. tumor necrosis factor receptor associated factor) UNG Uracil-N glikozilaza VDR Receptor za vitamin D VP Volumen prostate ZU Zdravilna učinkovina VIII

11 SEZNAM SLIK Slika 1: Biosintezna pot steroidnih hormonov (povzeto po viru (1)) Slika 2: Strukturna formula finasterid (8) in dutasterida (9)... 4 Slika 3: Prikaz delovanja Taqman sonde. (povzeto po viru (53)) Slika 4: Prikaz rezultatov alelne diskriminacije s sondo Taqman za polimorfizem -643C>T v genu za RANKL Slika 5: Koncentracija dihidrotestosterona v odvisnosti od zdravilne učinkovine Slika 6: Volumen prostate v odvisnosti od zdravilne učinkovine Slika 7: Rezultati IPSS vprašalnika v odvisnosti od zdravilne učinkovine Slika 8: Koncentracija dihidrotestosterona glede na polimorfizem v genu za CYP3A4 in CYP3A Slika 9: Volumen prostate glede na polimorfizem v genu za CYP3A4 in CYP3A Slika 10: Rezultati IPSS v odvisnosti od genotipov polimorfizma v genu za CYP3A4 in CYP3A SEZNAM PREGLEDNIC Preglednica I: Primerjava finasterida in dutasterida. (povzeto po virih (6; 7; 11; 12)... 5 Preglednica II: Znani polimorfizmi povezani z benigno hiperplazijo prostate Preglednica III: Najpogosteje preučevani polimorfizmi v genih za RANKL in OPG pri bolnikih z osteoporozo Preglednica IV: Povprečne koncentracije biokemičnih parametrov in standardni odkloni pred zdravljenjem, po 6 mesecih zdravljenja in po 1 letu zdravljenja Preglednica V: Sestava reakcijske zmesi za en vzorec Preglednica VI: Reakcijski pogoji in potek PCR reakcije Preglednica VII: Sestava reakcijske zmesi za en vzorec Preglednica VIII: Reakcijski pogoji in potek PCR reakcije Preglednica IX: Sestava reakcijske zmesi za en vzorec Preglednica X: Reakcijski pogoji in potek PCR reakcije Preglednica XI: Frekvence genotipov za polimorfizme v genih za RANKL, OPG, CYP3A5 in CYP3A4 iz naše analize in frekvence za evropsko populacijo (vir (56)) Preglednica XII: Koncentracije kliničnih parametrov pred zdravljenjem (1), po 6 mesecih zdravljenja (2) in po 1 letu zdravljenja (3) glede na zdravilno učinkovino IX

12 Preglednica XIII: Spremembe v koncentraciji kliničnih parametrov pred zdravljenjem in po 1 letu zdravljenja Preglednica XIV: Začetne koncentracije biokemičnih kazalcev kostne prenove glede na genotip polimorfizma -290C>T v genu za RANKL Preglednica XV: Spremembe v koncentraciji kazalcev kostne prenove glede na genotip polimorfizma -290C>T v genu za RANKL po 1 letu zdravljenja Preglednica XVI: Začetne koncentracije biokemičnih kazalcev kostne prenove glede na genotip polimorfizma -643C>T v genu za RANKL Preglednica XVII: Spremembe v koncentraciji biokemičnih kazalcev kostne prenove glede na genotip polimorfizma -643C>T v genu za RANKL po 1 letu zdravljenja Preglednica XVIII: Začetne koncentracije biokemičnih kazalcev kostne prenove glede na genotip polimorfizma K3N v genu za OPG Preglednica XIX: Spremembe v koncentraciji biokemičnih kazalcev kostne prenove glede na genotip polimorfizma K3N v genu za OPG po 1 letu zdravljenja X

13 1. UVOD 1.1 SINTEZA IN DELOVANJE ANDROGENOV Biosintezna pot steroidnih hormonov Med steroidne hormone uvrščamo androgene, progestagene, estrogene in kortikosteroide (1). Steroidni hormoni se sintetizirajo iz holesterola po biosintezni poti, ki je prikazana na sliki 1. Slika 1: Biosintezna pot steroidnih hormonov (povzeto po viru (1)). Androgeni so spojine iz 19 ogljikovih atomov, ki kontrolirajo razvoj in rast moških spolnih organov ter vzdržujejo moške spolne znake. Povečana sinteza androgenov vodi v bolezenska stanja, kot sta benigna hiperplazija prostate (BHP) in rak prostate (1). Testosteron sintetizirajo Leydigove celice v modih, ki so pod nadzorom luteinizirajočega hormona iz hipofize. Testosteron s pasivno difuzijo prehaja v celice prostate, kjer ga encim testosteron-5-alfa-reduktaza (5α-reduktaza) tipa II pretvori v dihidrotestosteron (DHT). Za pretvorbo testosterona v DHT je potreben reducirajoči kofaktor nikotinamid dinukleotid fosfat hidrat (NADPH), ki deluje kot donor vodikovega iona. Encim 5α-reduktaza tvori s kofaktorjem in testosteronom trimerni kompleks. Po prenosu vodikovega iona iz NADPH 1

14 na 5 ogljikov atom v aromatskem obroču se sintetizira DHT. DHT se sprosti iz trimernega kompleksa in kompleks 5α-reduktaza-NADP + se razklene. Encim nato lahko katalizira novo reakcijo (1) Delovanje testosterona in dihidrotestosterona Testosteron in dihidrotestosteron sta kemična prenašalca in liganda androgenih receptorjev. Testosteron in DHT se z enako hitrostjo vežeta na androgeni receptor in ga aktivirata, vendar pa se testosteron hitreje odstrani iz receptorja. S pretvorbo testosterona v DHT se poveča androgeni učinek, saj ima DHT večjo intrinzično jakost in večjo afiniteto do androgenega receptorja (2). Citoplazemski androgeni receptor (AR) spada v družino steroidnih jedrnih receptorjev. Po vezavi testosterona ali DHT na AR pride do spremembe konformacije receptorja, kar omogoči translokacijo kompleksa v jedro. V jedru AR tvori homodimere in interagira s specifičnimi zaporedji na deoksiribonukleinski kislini (androgen response elements) (1). Interakcija med AR in DNA sproži transkripcijske procese, ki so potrebni za modulacijo izražanja genov (2). Sintetizirajo se lahko proteini, kot je za prostato specifični antigen (PSA) ali pa regulatorni proteini, kot so rastni faktorji (npr. epidermalni rastni faktor (EGF), inzulinu podoben rastni faktor (IGF)), ki modulirajo proliferacijo celic, njihovo rast in funkcijo (3). 1.2 BENIGNA HIPERPLAZIJA PROSTATE Benigna hiperplazija prostate Prostata je pomožna spolna žleza, ki obdaja sečnico na izhodu iz mehurja. Prostato po McNealu razdelimo v 4 cone, in sicer periferno, centralno, prehodno in fibromuskolarno cono. V prehodni coni prostate je 5% žleznega tkiva in prav v tej coni lahko pride do povečane proliferacije epitelijskih in gladkomišičnih celic, kar vodi do benignega povečanja prostate (4). Benigno hiperplazijo prostate (BHP) definiramo kot kronično in počasi napredujočo bolezen, ki se izrazi kot nerakasto povečanje prostate in prizadene predvsem starejše moške. Dejavniki tveganja za BHP so starost, velikost prostate nad 30 ml in PSA nad 1,5 ng/ml ter metabolni sindrom in pridružena družinska obremenjenost z boleznimi prostate (5). 2

15 Benigna hiperplazija je najpogostejši razlog za simptome spodnjih sečil (LUTS lower urinary tract simptoms). Simptomi spodnji sečil so posledica tako statične (povečana prostata) kot dinamične komponente (povečan tonus mišic prostate). Dinamična komponenta je posledica stimulacije adrenergičnih receptorjev α 1A preko simpatičnega živčnega sistema, statična komponenta pa je pogojena s pretvorbo testosterona v DHT. Simptome spodnjih sečil delimo na motnje praznjenja mehurja, ki se kažejo kot slab in prekinjajoč curek, otežen začetek uriniranja ter uhajanje urina po kapljicah, na motnje shranjevanja seča, ki se kažejo kot pogosto uriniranje podnevi in ponoči ter na težave po koncu uriniranja. Izraženost simptomov spodnjih sečil ocenimo z mednarodnim IPSS vprašalnikom. S skupnim seštevkom točk ločimo bolnike z blagimi težavami (0-7), zmernimi težavami (8-19) in hudimi težavami (20-35). Za diagnosticiranje BHP se poleg IPSS vprašalnika uporabljajo še različne preiskave, kot so digitalni rektalni pregled prostate, transrektalni ultrazvok, uroflavmetrija in uretrocistoskopija. V serumu pa se določa za prostato specifični antigen (PSA). PSA izloča tudi normalna prostata, vendar pa se njegova koncentracija pri BHP in raku prostate poveča nad 1,5 ng/ml. Če BHP ne zdravimo lahko pride do hujših zapletov, kot so akutno zadrževanje urina, vnetja sečil, hematurija in kronična zapora urina z ledvično odpovedjo (4) Zdravljenje benigne hiperplazije prostate Zdravila, ki se uporabljajo v terapiji BHP lahko razvrstimo v 3 skupine: zdravila rastlinskega izvora, antagonisti adrenergičnih receptorjev α 1A in zaviralci 5α-reduktaze. Pri zmernih do hudih simptomih BHP se najpogosteje uporabljajo antagonisti adrenergičnih receptorjev α 1A (afluzosin, tamsulozin, tarazosin, silodosin). Pri zelo povečani prostati (nad 40 cm 3 ) pa se uporabljajo zaviralci 5α-reduktaze, med katere spadajo finasterid, dutasterid, epristerid in ursolna kislina. Težave BHP lahko lajšamo tudi s kombinacijo antagonistov adrenergičnih receptorjev α 1A in zaviralcev 5α-reduktaze ali s kombinacijo antagonistov adrenergičnih receptorjev α 1A in antiholinergikov. Pokazalo se je, da ima kombinacija zdravil močnejši učinek pri lajšanju težav kot posamezno zdravilo (6). Cilj zdravljenja z zdravili je izboljšanje kakovosti življenja, izboljšanje pretoka urina in zmanjšanje tveganje za hujše zaplete kot sta akutno zadrževanje urina in operativni poseg (5). 3

16 Zaviralca encima 5α-reduktaza finasterid in dutasterid (slika 2) sta pri bolnikih z zmernimi do hudimi simptomi BHP indicirana za zdravljenje zmernih do hudih simptomov ter za zmanjšanje tveganja za akutno zadrževanje urina in potrebo po operativnem posegu (prostatektomija, transuretralna resekcija prostate) (7). Slika 2: Strukturna formula finasterida (8) in dutasterida (9). Finasterid in dutasterid delujeta kot kompetitivna zaviralca encima 5α-reduktaza. Po vezavi učinkovine na encim nastane trimerni kompleks med 5α-reduktazo, NADPH in učinkovino (1). NADPH donira vodikov ion dvojni vezi v aromatskem obroču učinkovine, kar omogoči kovalentno vezavo NADP + z dihidrofinasteridom oz. dihidrodutasteridom v aktivnem mestu encima (10). Tako učinkovini preprečita periferno pretvorbo testosterona v aktivno obliko DHT, ki v večji meri nadzoruje delovanje prostate. Posledično se znižata tako serumska kot tkivna koncentracija DHT, poviša pa se koncentracija testosterona. Zaradi nižje koncentracije DHT in hitrejše disociacije testosterona z androgenih receptorjev je celokupen učinek androgenov na prostato manjši (6). Učinek zaviralcev 5α-reduktaze se izrazi šele po nekaj mesecih zdravljenja, zato se priporoča neprekinjena terapija vsaj 6 mesecev. Z uporabo zaviralcev 5α-reduktaze se zmanjša volumen prostate za %, kar vodi v izboljšanje simptomov spodnjih sečil, prav tako se zmanjša tveganje za operativni poseg (11). 4

17 V preglednici I je prikazana primerjava farmakodinamičnih in farmakokinetičnih lastnosti zaviralcev 5α-reduktaze (finasterid, dutasterid). Preglednica I: Primerjava finasterida in dutasterida. (VP - volumen prostate, konc. DHT koncentracija dihidrotestosterona, AUR akutno zadrževanje urina) (povzeto po virih (6; 7; 12; 13)) Finasterid Dutasterid Odmerek na dan 5,0 mg 0,5 mg Razpolovni čas 6 ur 5 tednov Biološka uporabnost 65% 60% Vezava na plazemske proteine 90% 99% Metabolizem učinkovin s citokromi P450 3A4 3A4 in 3A5 Izločanje V obliki presnovkov z urinom in blatom V obliki presnovkov z blatom Pogosti neželeni učinki v prvem letu uporabe Impotenca, zmanjšan libido, motnje ejakulacije Impotenca, zmanjšan libido, motnje ejakulacije Selektivnost zaviranja encimov Tip II Tip I in tip II Znižanje plazemske konc. DHT po 1 letu 70% 90% Zmanjšanje VP po 2 letih 27% 20% Zmanjšanje števila točk IPSS po 2 letih 3,8 3,1 Zmanjšanje tveganja za AUR po 4 letih 57% 57% Iz podatkov v preglednici I lahko vidimo, da ni pomembnih razlik v zdravljenju med obema učinkovinama. V raziskavi II. faze kliničnega preizkušanja zdravil so uspeli dokazati, da dutasterid bolj zniža koncentracijo serumskega DHT v primerjavi s finasteridom. Do tega pride verjetno zaradi delovanja na oba tipa encima 5α-reduktaze. Pri bolnikih, ki so se zdravili z dutasteridom se je koncentracija DHT znižala za 94,7%, pri tistih, ki so prejemali finasterid pa za 70,8%. Razlik med finasteridom in dutasteridom pri zmanjšanju volumna prostate ter zmanjšanju tveganja za napredovanje bolezni, akutno zadrževanje urina in operativni poseg pa niso uspeli dokazati (14) Genetsko ozadje benigne hiperplazije prostate V več študijah so iskali povezavo med prisotnostjo polimorfizmov in tveganjem za pojav BHP. Rezultati študij si velikokrat nasprotujejo, kar kaže na to, da je bolezen poligenetska in da imajo pomembno vlogo pri pojavu bolezni poleg starosti in koncentracije moških spolnih hormonov tudi razlike v rasi in okoljski vplivi. Študije so pokazale, da so 5

18 prevalenca BHP, volumen prostate in celična sestava prostate različne med rasami. Znano je, da imajo Azijci, v primerjavi z belci in črnci, manjši volumen prostate ter da prostata vsebuje več žleznega tkiva in manj stromalnega tkiva (15). Preglednica II: Znani polimorfizmi povezani z benigno hiperplazijo prostate. Androgeni receptor Encim 17αhidroksilaza/ 17,20-liaza Receptor za vitamin D Encim 5αreduktaza tipa II (SRD5A2) Transformirajoči rastni faktor (TGF-β1) Inzulinu podoben rastni faktor I (IGF-I) Interlevkin-4 Poliglutaminska veriga (CAG) n Poliglicinska veriga (GGN) n 5 -neprevedljiva regija ApaI, BsmI Zamenjava valina z levcinom na kodonu 89 (V89L) Zamenjava alanina z treoninom na kodonu 49 (A49T) (TA) n ponovitve Kodon 29 (T29C) Število CA ponovitev VNTR Dokazali so šibko povezavo kratkih CAG ponovitev (manj kot 14) s povečanjem prostate in povečanim tveganjem za BHP pri belcih (16). Popolna delecija GGN verige vodi v zmanjšano transaktivacijo gena, niso pa dokazali povezave med manjšim številom GGN ponovitev in BHP (16). Homozigoti z mutiranim (A2/A2) genotipom imajo povečan volumen prostate in povečano tveganje za BHP (17). Dokazali so statistično značilno povezavo s povečanim tveganjem za BHP (15). Povezave med mutacijami V89L, A49T in (TA) n ponovitvami s simptomatsko ali nesimptomatsko BHP v celotni populaciji niso dokazali. Samo pri latinsko ameriški populaciji z LL genotipom so dokazali povečano tveganje za BHP (17; 18). Dokazali so, da polimorfizem V89L zmanjša aktivnost encima za 30% glede na nemutirano obliko, polimorfizem A49T pa poveča aktivnost encima za 5x (19). Moški z genotipom CT in TT imajo signifikantno večje tveganje za klinično izraženo BHP kot moški z genotipom CC (20). Povečano število CA ponovitev poveča tveganje za raka prostate in BHP v japonski populaciji (21). Dokazali so povečano tveganje za BHP in odziv bolnikov za terapijo (21). Za prostato specifični antigen je označevalec, s katerim lahko z veliko gotovostjo napovemo volumen prostate pri BHP, vendar pa koncentracija tega proteina naraste šele v poznem stadiju bolezni (17). Da bi izboljšali diagnostiko in napoved pojava bolezni, so začeli iskati polimorfizme v genih, ki bi lahko potencialno vplivali na povečano tveganje za BHP. Najprej so iskali polimorfizme v genih, ki kodirajo citokrome P450, 5α-reduktazo, androgeni receptor in receptor za vitamin D, saj so ti encimi in receptorji vključeni v 6

19 sintezo in/ali delovanje moških spolnih hormonov. Postavili so tudi hipotezo, da se poveča proliferacija celic zaradi provnetnih dejavnikov in tako so začeli raziskovati polimorfizme genov, ki kodirajo provnetne dejavnike in rastne faktorje. Najbolj raziskani polimorfizmi, ki so povezani z BHP so prikazani v preglednici II. 1.3 OSTEOPOROZA PRI MOŠKIH IN KOSTNA PRENOVA Osteoporoza pri moških Osteoporoza je s starostjo povezana degenerativna bolezen okostja. Za osteoporozo je značilna močno povečana lomljivost kosti, zaradi spremenjene mikroarhitekture kostnine in znižane kostne mase. Tveganje, da bo 50 letni moški bele rase zbolel za osteoporozo je 13-22%, verjetnost za zlom kolka pa 5-6% (22). Osteoporoza se pri moških pojavi večinoma zaradi sekundarnih vzrokov, med najpogostejše spadajo prekomerno uživanje alkohola, kajenje, premajhno uživanje kalcija, pomanjkanje vitamina D 3, terapija s kortikosteroidi in hipogonadizem. Pri približno 40% moških osteoporoza ni posledica sekundarnih vzrokov in takrat jo obravnavamo kot primarno (senilna osteoporoza) ali idiopatsko osteoporozo (23). Za vzdrževanje kostne homeostaze je tudi pri moških pomemben estrogen in njegovo pomanjkanje vodi do zmanjšanja kostne mase (24). Na kostni metabolizem deluje tudi testosteron, in sicer direktno (preko androgenega receptorja) in indirektno (aromatizira se do estrogena). Pri starejših moških je opazna nižja koncentracija testosterona, zato ima encim aromataza manj substrata in s tem se tvori manj estrogena (25). Vzrok za povečano izgubljanje kostnine s starostjo je tudi kopičenje reaktivnih kisikovih spojin v kosteh, kar vodi v aktivacijo osteoklastogeneze in povečano apoptozo osteoblastov. Estrogeni imajo antioksidativne lastnosti in tako ščitijo kosti pred oksidativnim stresom in pred znižanjem kostne mase (22). Mutacije v genih za estrogenske receptorje ali v genih za aromatazo so redko vzrok za osteoporozo. Spremembe v mineralni kostni gostoti (MKG) lahko diagnosticiramo z dvoenergijsko rentgensko absorpciometrijo (DXA), ki je zanesljiv napovednik zlomov. Kostna denziometrija se priporoča pri moških, starejših od 70 let, ali pri moških z visokim tveganjem za osteoporozo. Ker je hipogonadizem pogost vzrok osteoporoze, se z 7

20 laboratorijskimi testi določajo koncentracije celotnega testosterona in spolne hormone vezočega globulina (SHBG) (23). Nefarmakološki pristop k zdravljenju osteoporoze je nadomeščanje kalcija in vitamina D 3 ter telesna vadba s poudarkom na vajah za moč (23). Farmakološko pa osteoporozo lahko zdravimo z različnimi zdravili, in sicer z bisfosfonati (alendronat, risedronat, zoledronska kislina), paratiroidnim hormonom (teriparatid) in monoklonskimi protitelesi (denosumab) (26). Po smernicah se kot prva linija zdravljenja osteoporoze pri moških uporabljajo bisfosfonati (23) Kostna prenova in signalna pot RANK/RANKL/OPG Kosti se v procesu kostne prenove nenehno tvorijo in razgrajujejo kot odgovor na hormone, parakrine in avtokrine dejavnike ter mehanske sile. V kostno prenovo so vključene celice, ki razgrajujejo kostnino (osteoklasti) in celice, ki tvorijo kostni matriks (osteoblasti) (27). Osteociti so najštevilčnejše kostne celice, ki se razvijejo iz zrelih osteoblastov in omogočajo komunikacijo med celicami (28). Signalna pot RANK/RANKL/OPG je ključni regulatorni sistem osteoklastogeneze. Z odkritjem te poti je postalo jasno, da osteoblasti poleg izgradnje kostnega matriksa, nadzorujejo tudi delovanje osteoklastov. V to signalno pot so vključeni ligand receptorja za aktivacijo jedrnega faktorja κb (RANKL), receptor za aktivacijo jedrnega faktorja κb (RANK) in osteoprotegerin (OPG), ki spadajo v družino tumor nekrotizirajočih dejavnikov (TNF) (29). Osteoprotegerin (OPG) je bazni glikoprotein, ki se izraža v homomerni in homodimerni obliki. Primarno ga tvorijo stromalne celice kostnega mozga, B-limfociti, dendritične celice in osteoblasti. Izražanje v osteoblastih je inducirano s citokini, kot so interlevkin-1 (IL-1), interlevkin-18, transformirajoči rastni faktor-α (TGFα), transformirajoči rastni faktor-ß (TGFβ), steroidnim hormonom 17β-estradiol in vitaminom D 3 ter inhibirano s prostagladinom E 2, ciklosporinom A, paratiroidnim hormonom, inzulinu podobnim rastnim faktorjem-1 (IGF-1) in glukokortikoidi (30). OPG je topni receptor, ki se z visoko afiniteto veže na RANKL in tako prepreči njegovo vezavo na receptor RANK, s tem pa zavre diferenciacijo in aktivacijo osteoklastov (31). 8

21 Ligand receptorja za aktivacijo jedrnega faktorja κb (RANKL) je homotrimerni transmembranski protein tipa II in je sestavljen iz C-terminalne ekstracelularne receptorske domene in transmembranske domene. RANKL se izraža kot membranski protein. Po proteolitični odcepitvi z disintegrinsko - metaloproteazno domeno (ADAM) in matriksno metaloproteazo (MMP) pa najdemo RANKL kot topni protein. Topna oblika ima manjšo kapaciteto za osteoklastogenezo. RANKL se lahko veže tako na RANK kot na OPG (31). RANKL spodbuja sproščanje nezrelih predhodnikov osteoklastov v krvni obtok in aktivacijo večjedrnih zrelih osteoklastov, kar vodi v resorpcijo kosti. RANKL se izraža v T-limfocitih, osteoblastih, osteocitih, stromalnih celicah kosti in pljučnih celicah. Izražanje RANKL je visoko inducibilno in regulirano z več faktorji, kot so glukokortikoidi, paratiroidni hormon, vitamin D 3, IL-1 in prostagladin E 2. Izražanje RANKL pa inhibirata estrogen in TGF-β (32). Receptor za aktivacijo jedrnega faktorja κb (RANK) je homometrimerni transmembranski protein tipa I, ki se izraža v osteoklastnih predhodnikih, zrelih osteoklastih in dendritičnih celicah ter v rakastih celicah dojk in prostate. Izražanje modulirajo citokini TNFα, IL-1, IL-6, IL-11, glukokortikoidi in paratiroidni hormon (30). Za receptorje iz družine TNF je značilno, da nimajo kinazne aktivnosti in morajo zato aktivirati faktorje, ki omogočijo nadaljevanje signalne poti (32). Te faktorje imenujemo adaptorski proteini. Najbolj pomembni izmed njih spadajo v družino TRAF (TNF receptor associated factor) (33). Po vezavi RANKL na membranski receptor RANK se aktivirajo signalne poti z od RANKL odvisnim kinaznim signaliziranjem, ki vplivajo direktno na osteoklastogenezo ali pa na aktivacijo osteoklastov in njihovo preživetje. Signalne poti, ki se lahko aktivirajo po vezavi RANKL na receptor RANK so signalna pot preko TRAF6, TGF-ß aktivirane kinaze (TAK1) in jedrnega faktorja-κb (NF-κb), signalna pot preko TRAF2 ali TRAF5, indukcijske kinaze (NIK) in NF-κb, signalna pot preko TRAF2 ali TRAF5, z mitogeni aktivirane kinaze (MKK7) in N-terminalne kinaze c-jun (JNK), signalna pot preko src in fosfatidil-3-kinaze (PI3K) ter signalna pot preko src in proteinske tirozin kinaze-2 (PYK2) (34) Genetsko ozadje signalne poti RANK/RANKL/OPG Povezave med polimorfizmi v genih za RANKL in OPG in benigno hiperplazijo prostate še niso proučevali, tako da dobljenih podatkov ne moremo primerjati z drugimi študijami. V več študijah so iskali povezave med polimorfizmi v genih za RANKL in OPG in 9

22 osteoporozo, predvsem pri ženskah. Najpogosteje preučevani polimorfizmi so prikazani v preglednici III. Večina polimorfizmov teh genov je povezanih z mineralno kostno gostoto in ne s kazalci kostne prenove, ki smo jih preučevali. Preglednica III: Najpogosteje preučevani polimorfizmi v genih za RANKL in OPG pri bolnikih z osteoporozo (MKG C kortikalna mineralna kostna gostota). RANKL OPG rs CC genotip je povezan z znižanjem MKG c in povišano koncentracijo prostega RANKL v serumu (35). rs TT genotip je povezan z znižanjem MKG c ledvenih vretenc (35). rs AA genotip je povezan z znižanjem MKG c kolka (36). rs rs rs rs rs rs CCG haplotip je povezan z znižanjem MKG kolka in ledvenih vretenc (37). CCT haplotip je povezan z s povečanim izražanjem RANKL in znižano MKG (37). rs Šibka povezava z znižanjem MKG c ledvenih vretenc (36). rs GG genotip je povezan z znižanjem MKG c kolka (37) Vpliv spolnih hormonov na kostno prenovo V več študijah so preučevali vpliv spolnih hormonov na kostno prenovo. Ugotovili so, da imata pomembno vlogo tako testosteron kot estrogen ne glede na spol, vendar pa estrogen v večji meri vpliva na kostno resorpcijo kot testosteron Vpliv estrogena na kostno prenovo Estrogen vpliva na tvorbo, aktivacijo in apoptozo predhodnikov in zrelih kostnih celic. Ugotovili so, da estrogen regulira življenjsko dobo in aktivnost osteoklastov. Ob odtegnitvi estrogena se poveča aktivnost posameznega osteoklasta, podaljša njegova življenjska doba in zmanjša apoptoza, kar vodi v povečano resorpcijo kosti. Vsi ti učinki estrogena so posledica različnih avtokrinih in parakrinih mehanizmov, ki so lahko hitri (ne-genomski) ali počasni (preko estrogenskega receptorja). Estrogen naj bi moduliral aktivnost zrelih osteoklastov z direktnim zaviranjem izražanja genov za proteine kot so katepsini, ki so vključeni v degradacijo matriksa (38). Estrogen zavira izražanje in izločanje provnetnih citokinov (IL-1, IL-6, IL-11, IL-7, TNFα) in rastnih faktorjev, ki vplivajo na diferenciacijo in aktivnost osteoklastov. Regulacija izražanja provnetnih citokinov poteka po več poteh, kar bom prikazala na primeru 10

23 interlevkina-6 (IL-6). Estrogen zavira izražanje receptorja za IL-6 in izražanje citokina IL- 6 preko estrogenskih receptorjev ali direktno z inhibicijo promotorja za IL-6. Zaviranje promotorja poteka tako, da se estrogen veže na NF-κB in C/EBP ter zavira izražanje gena. Podoben zaviralni učinek estrogena lahko opazimo pri izražanju TNF-α in M-CSF (39). Po aktivaciji estrogenskega receptorja na osteoblastih pride do povečanega izražanja in izločanja TGF-β, ki zmanjša aktivacijo osteoklastov in poveča njihovo apoptozo (40). Dokazali so, da po obdelavi ko-kulture osteoklastov s TGF-ß pride do apoptoze celic zaradi povečanega izražanja OPG iz stromalnih celic (41). Estrogen regulira tudi signalni poti, ki ju inducira RANKL in sta pomembni pri proliferaciji in diferenciaciji osteoklastov. Signalni poti potekata preko jedrnega faktorjaκb (NF-κB) ali c-jun. V študiji so se sicer bolj osredotočili na vpliv estrogena na c-jun signalno pot, vendar pa so omenili, da estrogen blokira signalno pot NF-κB z zaviranjem delovanja NF-κB na promotor IL-6. Estrogen zavira izražanje gena za c-jun in fosforilacijo z N-terminalno kinazo c-jun (JNK) preko delovanja estrogenskih receptorjev na jedro (41). Estrogen lahko vpliva na izražanje RANKL in OPG tudi preko estrogen response elements binding proteins (ERE-BP), ki tekmujejo z estrogenskim receptorjem α za vezavo na specifične promotorje regulirane z estrogenom (estrogen response elements - ERE). ERE- BP so pomemben regulator osteoklastogeneze, diferenciacije osteoklastov in izražanja RANKL v kosteh. V stromalnih celicah in hematopoetskih predhodnikih osteoklastov povzročijo ERE-BP povečano izražanje RANKL, kar se pokaže z večjo diferenciacijo predhodnikov v zrele osteoklaste. ERE-BP prav tako pozitivno regulira signalno pot NFκB in poveča odzivnost te poti na RANKL. Povečano izražanje ERE-BP v kulturi osteoblastov stimulira izražanje RANKL in zmanjša izražanje OPG, kar vodi do spremembe razmerja OPG/RANKL v smer osteoklastogeneze. ERE-BP pa ne vplivajo na življenjsko dobo osteoklastov in druge faktorje (npr. TNFR), ki so prav tako vključeni v regulacijo osteoklastogeneze (42) Vpliv androgenov na kostno prenovo V študijah so opazovali učinek testosterona in DHT na kosti in dokazali, da naj bi bila nižja koncentracija prostega testosterona napovednik za znižano mineralno kostno gostoto (MKG). Pri starejših moških pride do znižanja testosterona zaradi degradacije Leydigovih celic v modih in manjše odzivnosti celic na luteinizirajoči hormon ter zaradi zvišanja 11

24 koncentracije spolne hormone vezočega globulina (SHBG), ki močno veže testosteron in prepreči prehod testosterona v tarčno tkivo (43). Oba dejavnika, torej nižja serumska koncentracija testosterona in višja serumska koncentracija SHBG, sta povezana s povečanim tveganjem na osteoporozne zlome (44). V in vitro študijah so dokazali, da moški spolni hormoni vplivajo na kostno prenovo po več mehanizmih. Androgeni povečajo proliferacijo osteoblastov in zmanjšajo njihovo apoptozo preko regulacije protein kinaze B, preprečijo s paratiroidnim hormonom inducirano tvorbo osteoklastov, zmanjšajo resorpcijo kosti z deaktivacijo lizosomalnih encimov, stimulirajo sintezo kolagena tipa 1α1, osteokalcina in mineralizacijo matriksa (43; 45). Tako kot estrogen tudi androgeni delujejo na kostne celice preko receptorjev za steroidne hormone. Androgeni receptorji se izražajo samo na osteoblastih in osteocitih (45). Testosteron in DHT aktivirata androgeni receptor in modulirata različne celične funkcije osteoblastov in osteoklastov. V in vitro študijah so dokazali, da po aktivaciji androgenega receptorja s testosteronom ali DHT, pride do regulacije izražanja genov za citokine (IL-1, IL-6 in TNFα), prostagladin E 2, rastne faktorje in topni receptor OPG v osteoblastih (45; 46). Testosteron in DHT zavirata signalno pot, ki jo inducirata RANKL in M-CSF, tako da zavirata aktivnost in izražanje transkripcijskega faktorja c-jun in signalno pot SAPK/ JNK1. Pokazalo se je, da DHT ne zavira z RANKL inducirane aktivacije NF-κB, kot lahko opazimo pri delovanju estrogena (46). Na začetku je veljalo prepričanje, da je glavni hormon, ki regulira kostno prenovo pri moških testosteron, pri ženskah pa estrogen. Vendar so študije dokazale, da sta oba spolna hormona enako pomembna v vzdrževanju homeostaze kosti in kostne prenove pri obeh spolih. Ob pomanjkanju testosterona ali estrogena se poveča število predhodnikov osteoklastov in poveča odzivnost celic na oba hormona (46). 1.4 POLIMORFIZMI ENCIMOV IZ DRUŽINE CITOKROMOV P450 Zdravilni učinkovini finasterid in dutasterid se v jetrih presnavljata z encimoma, ki spadata v družino citokromov P450. Finasterid se presnavlja z encimom CYP3A4, dutasterid pa z encimoma CYP3A4 in CYP3A5 (7; 11). Citokromi so najpomembnejši encimski sistem, ki 12

25 je vključen v biotransformacijo endogenih snovi, kot so steroidni hormoni in maščobne kisline ter eksogenih snovi med katere spadajo tudi zdravilne učinkovine (47). Poznamo več kot 50 izomer citokromov, ki jih lahko razdelimo v 3 velike družine, in sicer v družino izomer 5-51, izomer 1-3 in izomere 4. Encima CYP3A4 in CYP3A5 spadata v družino izomer 1-3. Ti encimi so odgovorni za 70-80% celotnega metabolizma zdravilnih učinkovin v prvi fazi metabolizma (47). Encima CYP3A4 in CYP3A5 katalizirata monooksigenazno reakcijo, ki omogoča bioaktivacijo učinkovine ter deaktivacijo in izločanje učinkovine (48). Večina encimov kaže interindividualno variabilnost v katalitični aktivnosti zaradi genetske variabilnosti ali različne stopnje izražanja. Za te encime pravimo, da so polimorfni, kar pomeni, da je frekvenca variabilnega alela v normalni populaciji vsaj 1%. V družini izomer CYP 1-3 je večina genov tudi funkcionalno polimorfnih, z izjemo CYP3A4, CYP2E1 in CYP1A1, ki so relativno dobro ohranjeni. Polimorfizmi v genih za presnovne encime vodijo do različnih odzivov na zdravilno učinkovino. Poznamo 4 specifične fenotipe presnavljalcev, ki jih lahko določimo s fenotipizacijo ali alelno diskriminacijo. Ti fenotipi so počasni presnavljalci, srednje hitri presnavljalci, hitri presnavljalci in ultra hitri presnavljalci. Za ultra hitre presnavljalce je značilno, da imajo več kot 2 kopiji aktivnega gena, kar vodi v hitrejši metabolizem in zelo verjetno je, da posameznik ne doseže terapevtske koncentracije pri normalnem odmerku zdravilne učinkovine (ZU). Pri hitrih presnavljalcih se izražata 2 popolnoma aktivna alela in pri njih dosežemo pričakovani odziv na normalni odmerek ZU. Posamezniki, ki so srednje hitri presnavljalci, so homozigoti za alela z zmanjšano aktivnostjo ali heterozigoti z enim neaktivnim alelom. Pri njih se lahko pojavijo blagi neželeni učinki. Za počasne presnavljalce pa je značilno, da ne izražajo aktivnih alelov in občutijo več neželenih učinkov pri normalnem odmerku ZU zaradi počasnejše presnove učinkovin in povišane koncentracije učinkovine (47) Vpliv polimorfizmov na delovanje CYP3A4 Največ encima CYP3A4, ki metabolizira okrog 50% vseh uporabljenih zdravilnih učinkovin, se izraža v jetrih. Encim CYP3A4 ima pomembno vlogo tudi pri metabolizmu endogenih snovi kot so žolčne kisline in steroidni hormoni (47). V izražanju jetrnega CYP3A4 obstaja velika interindividualna variabilnost. Odkrili so več kot 20 mutacij v genu za CYP3A4. V in vitro testih so dokazali, da mutacije 13

26 CYP3A4*8,*11,*13,*17 vodijo do zmanjšane aktivnosti alela, mutacija CYP3A4*20 v popolno neaktivnost alela in mutacija CYP3A4*18A v povečano aktivnost alela. Polimorfizmi v genu za CYP3A4 lahko vodijo do zmanjšane ali povečane aktivnosti alela, vendar pa zaradi nizke frekvence alelov ne moremo razložiti pogostih interindividualnih razlik v aktivnosti CYP3A4. Razlogi za različno izražanje, inducibilnost in aktivnost CYP3A4 se lahko nahajajo v polimorfizmih v genih za proteine (PXR, CAR, GR ligandi), ki regulirajo transkripcijo encima CYP3A4 in genih, ki nadzorujejo postranslacijo proteina (47) Vpliv polimorfizmov na delovanje CYP3A5 Gen za encim CYP3A5 se izraža v različnih tkivih (jetra, črevesje, prostata), vendar v manjši meri kot gen za CYP3A4. Le okrog 20% ljudi izraža jetrni encim CYP3A5. Znanih je več kot 200 polimorfizmov v genu za CYP3A5, ki vplivajo na sintezo funkcionalnega encima. Polimorfizmi CYP3A5*3,*6 in *7 so povezani s tveganjem za raka prostate in njegovo agresivnost. Najpogostejši razlog za manjše izražanje gena in manjšo aktivnost encima je mutacija na izrezovalnem mestu (CYP3A5*3). Ta mutacija povzroči spremembo v številu nukleotidov na mestu, kjer se ločijo introni in eksoni pri transkripciji pre-mrna v zrelo mrna (47). Izražanje CYP3A5 je torej odvisno od polimorfizma CYP3A5*3, saj se zmanjša količina normalno ločene mrna in s tem funkcionalnega proteina (49). Več neodvisnih študij je pokazalo, da je očistek nekaterih zdravilnih učinkovin počasnejši pri posameznikih, ki nosijo dva mutirana alela CYP3A5*3 (47). Gen za CYP3A5 se izraža tudi v prostati, vendar v manjši meri kot v jetrih. V prostati CYP3A5 sodeluje pri metabolizmu endogenih snovi, kot so androgeni. Z oksidacijo testosterona in dehidroepiandrosterona v bazolateralnih celicah prostate, bi lahko CYP3A5 kontroliral njun vstop v luminalne celice, katerih rast je odvisna od hormonov. Androgeni povečajo izražanje CYP3A5 v prostati in to lahko kaže na avto-regulatorni krog v kontroli testosterona. Polimorfizem CYP3A5 bi lahko vplival na oksidacijo androgenov v bazolateralnih celicah in posledično na rast luminalnih celic ter razvoj raka prostate (48). Prav tako lahko kombinacija CYP3A4*1B in CYP3A5*3 haplotipa vpliva na povečano tveganje za raka prostate in njegovo agresivnost (47). 14

27 2. NAMEN DELA Benigna hiperplazija prostate je kronična in počasi napredujoča bolezen, ki prizadene starejše moške. Bolezen lahko zdravimo z zaviralci 5α-reduktaze (finasterid, dutasterid), ki zavirajo pretvorbo testosterona v dihidrotestosteron. Pri terapiji z zaviralci 5α-reduktaze obstajajo interindividualne razlike v odzivu na zdravljenje, kar bi lahko bilo posledica razlik v genetskem ozadju. V presnovo finasterida in dutasterida sta vključena citokroma P450 CYP3A4 in CYP3A5 zato smo hoteli preveriti, ali polimorfizmi v teh 2 genih vplivajo na metabolizem obeh učinkovin in na potek zdravljenja. Ker zaviralci 5αreduktaze zavirajo sintezo aktivnih spolnih hormonov, ki imajo pomembno vlogo pri patogenezi osteoporoze, smo se odločili, da bomo pri bolnikih z BHP raziskali vpliv zdravljenja z zaviralci 5α-reduktaze in spremenjenih koncentracij spolnih hormonov na kostno prenovo. V naši raziskavi bomo zato preverili naslednji hipotezi: 1. Prisotnost polimorfizmov v genu za CYP3A4 in genu za CYP3A5 vpliva na potek zdravljenja z zaviralci 5α-reduktaze pri moških z benigno hiperplazijo prostate. 2. Zdravljenje z zaviralci 5α-reduktaze vpliva na kostno prenovo pri moških z benigno hiperplazijo prostate in je odvisno od genetskih sprememb v genih za RANKL in/ali OPG. V ta namen bomo: V študijo vključili 70 moških z benigno hiperplazijo prostate, ki jim bomo odvzeli polno kri in naredili splošno biokemijsko analizo seruma ter izmerili biokemijske kazalce kostne prenove. Bolniki bodo morali izpolniti mednarodni vprašalnik o simptomih prostate (IPSS). Izmerili bomo tudi telesno težo, obseg pasu in volumen prostate. Bolnike bomo po vključitvi v raziskavo spremljali še eno leto in jih ponovno klinično in laboratorijsko pregledali po 6 mesecih in po 1 letu. 35 bolnikov bo 1 leto prejemalo finasterid in 35 bolnikov dutasterid. S kvantitativno verižno reakcijo s polimerazo bomo izvedli alelno diskriminacijo in analizirali vzorce z izolirano DNA za polimorfizme 15389C>T v genu za CYP3A4, 6986A>G genu za CYP3A5, -290C>T in -643C>T v genu za RANKL ter K3N v genu za OPG. 15

28 S statistično analizo bomo ugotavljali uspešnost zdravljenja s posamezno zdravilno učinkovino in skušali oceniti interindividualne razlike v uspešnosti zdravljenja v naši skupini preiskovancev. S statistično analizo bomo ugotavljali povezavo med polimorfizmoma 15389C>T v genu za CYP3A4 in 6986A>G genu za CYP3A5 in primarnimi izidi zdravljenja bolnikov z benigno hiperplazijo prostate. S statistično analizo bomo ugotavljali povezavo med polimorfizmi -290C>T in - 643C>T v genu za RANKL ter K3N v genu za OPG in kazalci kostne prenove. 16

29 3. MATERIALI IN METODE 3.1 OPIS PREISKOVANCEV V raziskavo FI-DU smo vključili 70 moških z benigno hiperplazijo prostate, ki se zdravijo s finasteridom (5 mg/dan) ali dutasteridom (0,5 mg/dan). Moške smo razdelili v dve enako veliki skupini glede na zdravilo, ki ga prejemajo. Podatke o zdravstvenem stanju bolnikov smo dobili iz anamneze in krvnih preiskav, ki so jih izvedli na urološkem oddelku Splošne bolnišnice Celje. Za določanje koncentracij kostnih kazalcev (CTX, OC, P1NP) smo uporabili elektro-kemiluminiscenčno metodo (ECLIA), za koncentracijo spolnih hormonov pa encimsko-imunski test (EIA). Enake parametre smo izmerili ob vključitvi bolnikov v študijo, po šestih mesecih zdravljenja in po enem letu zdravljenja. Vsi bolniki so podpisali izjavo o privoljenju za sodelovanje v raziskavi. Raziskavo je odobrila Komisija RS za medicinsko etiko (št. 81/02/12). Preglednica IV: Povprečne koncentracije biokemičnih parametrov in standardni odkloni pred zdravljenjem, po 6 mesecih zdravljenja in po 1 letu zdravljenja. Biokemični parametrov Enota Pred zdravljenjem Po 6 mesecih zdravljenja Po 1 letu zdravljenja Za prostato specifični antigen mmol/l 2,99±1,92 1,87±2,06 1,48±1,37 (PSA) Testosteron (T) nmol/l 16,4±5,9 18,8±6,9 18,8±6,9 Dihidrotestosteron (DHT) nmol/l 1,42±0,83 0,49±0,50 0,33±0,32 Estrogen (E) nmol/l 0,08±0,03 0,11±0,10 0,12±0,03 Spolne hormone vezoči globulin nmol/l 51,9±23,5 50,2±20,9 48,6±20,2 (SHBG) Proteini (prot) g/l 75±4 72±6 70±6 Albumin (alb) g/l 45±2 46±2 45±2 Parathormon (PTH) ng/l 56±22 56±26 58±29 C-terminalni telopeptid (CTX) pmol/l 0,23±0,11 0,27±0,14 0,31±0,14 Osteokalcin (OC) µg/l 21,42±6,63 21,77±7,00 21,22±7,16 Propeptidi prokolagena 1 nmol/l 41,68±18,35 43,29±17,02 40,45±16,31 (P1NP) Vitamin D (VitD) nmol/l 23,06±8,89 24,34±9,72 24,05±10,38 17

30 Iz anamneze smo dobili podatke o starosti, volumnu prostate, telesni teži in obsegu pasu. Bolniki so bili stari od 51 do 79 let s povprečno starostjo in standardnim odklonom 67±7 let. Določili smo povprečno vrednost in standardni odklon telesne teže (85,0±12,8kg) in obsega pasu (102,7±8,9cm). Vsi bolniki so imeli izmerjeni volumen prostate vsaj 30,0 ml s povprečno vrednostjo in standardnim odklonom 46,7±15,4mL. Bolniki so morali izpolniti mednarodni vprašalnik o simptomih prostate (IPSS), ki sprašuje o resnosti simptomov spodnjega urinarnega trakta (LUTS) in kvaliteti življenja posameznika. Povprečna vrednost rezultata IPSS vprašalnika je 15±5, kar kaže, da imajo bolniki zmerne simptome spodnjega urinarnega trakta. Bolnikom smo odvzeli vensko kri z EDTA za izolacijo DNA. V serumu smo določili tudi biokemijske kazalce, ki so prikazani v preglednici IV. 3.2 ALELNA DISKRIMINACIJA Kvantitativna verižna reakcija s polimerazo V preteklih letih je alelna diskriminacija oz. genotipizacija polimorfizma enega nukleotida (SNP) postala vodilna tehnologija genetskih raziskav in razvili so več metod za določanje SNP. Mi smo izvedli alelno diskriminacijo v končni točki s kvantitativno verižno reakcijo s polimerazo (qpcr). Reakcijska zmes za izvedbo PCR reakcije je sestavljena iz dveh oligonukleotidnih začetnikov, štirih vrst deoksiribonuklozid trifosfatov, DNA odseka, ki ga želimo podvojiti, Mg + ionov, reakcijskega pufra, termostabilne DNA-polimeraze (Taqpolimeraza) in fluorescentno označene sonde, ki omogoča detekcijo nastalega produkta med pomnoževanjem (50). Poznamo nespecifični način detekcije z barvili, ki se vežejo na dvoverižno DNA (SYBR Green I) in specifični način detekcije, pri katerem najpogosteje uporabimo hidrolizirajoče sonde, hibridizirajoče sonde ali molekularna svetila (51). V naši analizi smo uporabili hidrolizirajoče sonde Taqman MGB (minor groove binder). Taqman MGB sonde so sekvenčno specifične fluorescentno označene oligonukleotidne sonde. Na 5 -koncu so označene z reporterskim fluorescentnim barvilom, na 3 -koncu pa z MGB in nefluorescentnim dušilcem (NFQ) (52). Sonda ne oddaja fluorescentnega signala zaradi bližine dušilca, saj dušilec absorbira sproščeno svetlobo reporterskega barvila. Tak prenos energije iz ene fluorescentne molekule (donor) na drugo (akceptor) imenujemo fluorescenčni resonančni prenos energije ali FRET. Sonda lahko oddaja fluorescentni signal samo po ločitvi dušilca in reporterskega barvila (53). 18