Univerza v Ljubljani Fakulteta za kemijo in kemijsko tehnologijo Univerzitetni študijski program Kemija Izbirni sklop analizna in anorganska kemija Avtomatizirana analiza Seminar 2012 Predavatelj: prof. dr. Boris Pihlar Seminarska naloga je izdelana v okviru študijskih obvez dodiplomskega izbirnega predmeta Avtomatizirana analiza (30-0641). Delo ni lektorirano ali vsebinsko korigirano s strani predavatelja ali drugih univerzitetnih inštitucij. Avtor in inštitucija ne jamčita za pravilnost podatkov in navedb ter ne izključujeta možnosti, da so v objavljenem gradivu napake ali druge nepravilnosti. Gradivo predstavljeno v tem delu je avtorska lastnina, oziroma last navedenih virov, iz katerih je bilo povzeto.
Fakulteta za kemijo in kemijsko tehnologijo Avtomatizirana analiza, 4. letnik UNI-kemija Analiza polikloriranih bifenilov (PCB) v transformatorskem olju z uporabo mikrofluidnih naprav Povzeto po članku: Arata Aota, Yasumoto Date, Shingo Terakado, Hideo Sugiyama, and Naoya Ohmura; Analysis of Polychlorinated Biphenyls in Transformer Oil by Using Liquid_Liquid Partitioning in a Microfluidic Device, Anal. Chem. 2011, 83, 7834 7840 KAZALO Marko Zmazek Junij, 2012
1. POVZETEK... 2 2. UVOD... 3 3. EKSPERIMENTALNI DEL... 4 3.1 DELOVNA PROCEDURA... 4 3.2 IMUNOLOŠKI TEST... 4 3.3 PREDOBDELAVA OLJA... 4 4. REZULTATI IN DISKUSIJA... 5 5. ZAKLJUČEK... 10 6. VIRI... 10 1. POVZETEK Poliklorirani bifenili, ki so prisotni v transformatorskem olju, zaradi svoje toksičnosti in obstojnosti predstavljajo velik svetovni problem. Zaradi številnih transformatorjev, ki so še vedno v uporabi, je bil razvoj hitre in nizko cenovne metode za merjenje PCBjev v transformatorskem olju velika prioriteta. Kljub temu, da hitra in dokaj poceni
metoda že obstajaa pa je potrebna še cenejša in enostavnejša metoda. Obstoječa metoda vključuje imunološki test pri katerem se uporabljajoo večplastna kolonska separacija, izparevanje heksana, ekstrakcija z DMSO, reakcije med antigeni in protitelesi ter sistem za merjenje koncentracije PCB-jev. Slika 1: Struktura polikloriranegaa bifenila [2] 2. UVOD Najpomembnejša aplikacija PCB-jev je bila uporaba za različne električne naprave. Večinoma so se uporabljali pri izdelavi kondenzatorjev in transformatorjev, in sicer zaradi velike toplotne obstojnosti in nizke prevodnosti. Ko je postalo očitno, da so PCB-ji zelo toksične snovi in se zelo počasi razkrajajo, poleg tega pa so sposobne bioakumulacije, je njihova proizvodnja in uporabaa postala prepovedana. Ena prvih držav, ki je prepovedala njihovo proizvodnjo je bila Japonskaa (1972) in sicer zaradi incidenta, ki se je leta 1968 zgodil v mestu Yusho, kjer je zaradi onesnaženosti riževega olja s PCB-ji zbolelo več kot 1800 ljudi, okoli 300 pa jih je umrlo. V združenih državah so proizvodnjo prepovedali leta 1976. Širom sveta pa so jih prepovedali s Stockholmsko konvencijoo leta 2001. Na žalost pa zaradi obstojnosti PCB-jev in njihove množične uporabe pred prepovedjo proizvodnje, kontaminacija s PCB-ji še vedno ostaja velik problem. Trenutni predpisi na Japonskem ne dovoljujejo PCB koncentracij višjih od 0,5 mg/kgg transformatorskegaa olja. Kljub temu, da Japonska PCB-jev namerno ne uporablja več od leta 1973 pa se v starih transformatorjih, ki so še vedno v uporabi, najde veliko transformatorskega olja s stopnjo kontaminacije višjo od dovoljene. Da bi te transformatorje našli in jih odstranili iz uporabe, je Japonska izdala ukaz za pregled vsakega transformatorja v uporabi. Metode, ki se na splošno uporabljajo za detekcijo PCB-jev so plinska kromatografija sklopljena z masno spektrometrijo (GC/MS) ali sklopljena z detekcijo z elektronskim zajetjem (GC/ECD). Te metode so drage in dolgotrajne. Pojavila se je potreba po cenejših, hitrejših in preprostejših metodah. V zadnjih letih je bilo veliko zanimanja za mikrofluidne naprave (lab-on-a-chip), ki so jih razvili za miniaturizacijo kemičnih sistemov in integracijo različnih kemičnih procesov. Te naprave imajo veliko prednosti, kot so: krajši čas analize, manjša poraba vzorca in reagentov, manjši odpadni volumen, učinkovitejšee reakcije in
prenosljivost analiznega sistema. Če bi kemične procese imunološkega testa za PCB-je uspelo integrirati na mikročip, bi lahko razvili prenosljivi PCB analizni sistem. Procesi povezani z imunološkim testom za PCB-je v olju vključujejo ekstrakcijo na trdni fazi, uparevanje heksana, ekstrakcijo tekoče-tekoče, mešanje in adsorpcija. Z razvojem zelo učinkovite in enostavne ekstrakcije, za majhno količino olja, bi se lahko količina potrebnih reagentov zmanjšala, izparevanje heksana pa sploh ne bi bilo več potrebno. V tem članku so se osredotočili na ekstrakcijo PCB-jev iz izolacijskega olja z uporabo DMSO-ja in mikrofluidne naprave 3. EKSPERIMENTALNI DEL 3.1 Delovna procedura Raztopine so v čip uvajali s pomočjo mikrobrizg, pretok pa so nadzorovali z mikročrpalkami. Za povezavo brizg na jeklene bloke z teflonskimi obročki, ki so bili priterjeni na vhod mikročipa, so uporabili cevke iz poli eter eter ketona (PEEK). 3.2 Imunološki test PCB imunološki test so izvedli z KinExA 3000. Antigeni so bili imobilizirani na N- hidroksisukcinimid aktivirano sepharoso. Trdna faza sklopljena z antigeni je ujeta v majhni pretočni celici na fokusni točki fluorometra. Vzorec so zmešali z protitelesi, ki so bila fluorescenčno označena. Zmes so nato spustili skozi trdno fazo z antigeni. Protitelesa, ki so se vezala na analit (PCB), se niso več mogla vezati na antigene in so zato stekla skozi pretočno celico. Le majhen delež protiteles se je ujel na trdno fazo. Z fluorometrom so nato izmerili fluorescentno akumulacijo na trdni fazi. Vzorec, ki ni vseboval PCB-jev je dal najvišji odziv, vzorec z visoko koncentracijo PCB-jev pa je vodil do popolne inhibicije signala. 3.3 Predobdelava olja Čiščenje PCB-jev je potekalo na večplastni koloni. Zgornja plast je bila iz 0.75 g brezvodnega natrijevega sulfata, druga plast je bila iz 2 g silikagela impregniranega z oleumom, tretja plast je bila ponovno 0.75 g brezvodnega natrijevega sulfata, spodnja plast pa je bila iz 1.5 g aminopropil silikagela (Slika 2). Koloni so dodali 295 µl olja in počakali 3 minute, da je prišlo do reakcije med oleumom in ogljikovodikovimi verigami v olju. Nato so koloni dvakrat dodali 75 µl heksana, da so olje, ki je ostalo v zgornji fazi, sprali v silikagelsko fazo impregnirano z oleumom. 1minuta je bila dovoljena za reakcijo. Potem so kolono sprali z 10 ml heksana in zbrali vso tekočino, ki je prišla skozi kolono. Heksan so izparili na rotavaporju.
Preostalo tekočino so uporabili kot eksperimentalni vzorec olja za ekstrakcijo na mikročipu. Slika 2: Shematski prikaz večplastne silikagel kolone, ki se uporablja za čiščenje PCB-jev v olju 4. REZULTATI IN DISKUSIJA Mikro vdolbinice na čipu, ki potekajo vzdolž glavnega mikrokanala, služijo za zadrževanje DMSO-ja, v katerem poteka ekstrakcija PCB-jev. Najprej so skozi mikrokanal spustili DMSO. Ta je zapolnil tudi mikro vdolbinice. Nato so skozi mikrokanal spustili s PCB-ji kontaminirano olje, pri čemer je prišlo do ekstrakcije PCB-jev v DMSO, ki je ostal v mikro vdolbinicah. Olje so nato odstranili s pretokom zraka skozi mikrokanal. Zrak se uporablja za preprečitev kontaminacije vzorca z oljem. Na koncu so PCB-je ekstrahirane v DMSO-ju iz mikro vdolbinic odstranili z puferno raztopino. Tako pripravljen vzorec so analizirali z imunološkim testom.
V tej študiji so preučili tudi faktor obogatitve. Pri konvencionalni ekstrakciji z DMSO, z enakim volumnom olja in DMSO-ja, lahko PCB koncentracijo po ekstrakciji izrazimo kot kjer je K porazdelitveni koeficient, C O je koncentracija PCB-ja v olju po ekstrakciji, C D je koncentracija PCB-ja v DMSO-ju po ekstrakciji, C Oi pa je začetna koncentracija PCB-ja v olju. V primeru ekstrakcije na mikročipu, DMSO, ki se zadržuje v mikro vdolbinicah, neprekinjeno prihaja v stik z oljem z visokimi koncentracijami PCB-ja, saj skozi mikrokanal neprekinjeno teče sveže olje. Koncentracijo PCB-ja v DMSO-ju v tem primeru lahko izrazimo kot kjer je C D(mikro) koncentracija PCB-ja v DMSO-ju po mikrofluidni ekstrakciji. Z uporabo prve in druge enačbe lahko izrazimo obogatitveni faktor med konvencionalno in mikrofluidno ekstrakcijo Za določitev obogatitvenega faktorja je torej bilo najprej potrebno določiti porazdelitveni faktor K. Pripravili so olje kontaminirano s PCB-ji. Komercialno mešanico PCB-jev so dodali izolirnemu olju, ki so ga pred tem obdelali z večplastno kolono in rotavaporjem. 300 µl kontaminiranega olja, ki je vsebovalo 2.22 ± 0.17 mg/l, je bilo ekstrahiranega s 300 µl čistega DMSO-ja. Mešanico so 1 minuto centrifugirali na 10 000 rpm. Nato so odstranili 170 µl spodnje faze DMSO-ja, ki ni vsebovala olja. Tako pripravljen vzorec so nato analizirali z imunološkim testom. Koncentracija PCB-ja je znašala 1.37 ± 0.13 mg/l. Na osnovi tega so lahko izračunali porazdelitveni koeficient K, ki je znašal 0.62 ± 0.12 in pa obogatitveni faktor, ki je znašal 2.61 ± 0.51 Slika 2 prikazuje fotografijo čipa in sliko posneto z vrstičnim elektronskim mikroskopom (SEM). Širina glavnega mikrokanala je 250 µm, globina 50 µm in dolžina 610 mm. Vsaka od 1472 mikro vdolbinic ima okroglo obliko s premerom 250 µm in globino 50 µm. Volumen posamezne vdolbinice je bil ocenjen na 2.3 nl, totalni volumen vdolbinic pa na 3.5 µl.
Slika 3: Fotografija in SEM slika mikročipa Kontrola pretoka v mikročipu je bila ocenjena z raztapljanjem natrijeve soli fluoresceina. Fluorescentni DMSO so uvajali v mikročip. Ker so fluorescenco opazili v vseh mikro vdolbinicah (kot kaže slika 4A), je bilo evidentno, da so vdolbinice napolnjene le z DMSO-jem brez zračnih mehurčkov. Nato so skozi mikrokanal spustili olje. Čeprav so se v nekaterih mikro vdolbinicah pojavile zelo majhne kaplice olja, kot kaže slika 4B, je olje teklo le skozi glavni mikrokanal. Potem so olje iz mikrokanala odstranili s prepihovanjem z zrakom (slika 4C). Na koncu pa so v mikrokanal uvajali pufer PBSB. DMSO se je v tem pufru raztopil in iztekel iz mikro vdolbinic proti izhodu mikročipa (slika 4D). Majhne kapljice olja pa so pri tem ostale v vdolbinicah, zato vzorec ni vseboval nobenega olja, ki moti analizo z imunološkim testom. S tem so potrdili uporabnost mikročipa za ekstrakcijo z DMSO. Slika 4: Gibanje tekočin v mikročipu z mikro vdolbinicami. Fluorescentni DMSO je predstavljen kot sivo obarvan del na sliki. (A) mikro vdolbinice so bile uspešno zapolnjene z
DMSO brez zračnih mehurčkov. (B) V mikrokanal je steklo olje. Le redko katera oljna kapljica je zašla v mikro vdolbinico. (C) Olje v mikrokanalu je bilo odstranjeno s prepihovanjem z zrakom, DMSO je ostal v vdolbinicah. (D) DMSO se je v pufru raztopil in se eluiral. Slika 5: Fluorescein [3] Učinkovitost ekstrakcije je odvisna od časa kontakta med DMSO-jem in oljem. Če je pretok olja skozi mikrokanal prevelik, je čas kontakta premajhen in obogatitvenega faktorja, ki so ga izračunali, ni mogoče doseči. Odvisnost učinkovitosti ekstrakcije od kontaktnega časa so preverilii s spreminjanjem pretoka. 50 µl obdelanega olja, ki je vsebovalo 0.5 mg/kg PCB-jev so analizirali pri pretokih 10, 20, 40, 100 in 300 µl/min. Relativnii odzivi z stopnjo napake so prikazani na sliki 6. Nižjii relativni odziv ustreza višji koncentraciji PCB-jev v DMSO-ju. Pri pretokih 10 in 20 µl/min ni bilo opaziti razlike v relativnem odzivu. Ker jim je pretok 20 µl/min predstavljal zadosten kontaktni čas, so se odločili za ta pretok. Slika 6: Odvisnost učinkovitosti ekstrakcije od pretoka olja skozi mikrokanal
Tudi eluacija DMSO-ja je odvisna od pretoka pufra, zato so preučili tudi to odvisnost. V mikrokanal so uvajali 1 ml pufra PBSB, in sicer pri pretokih 100, 300, 500, 700 in 900 µl. Relativni odzivi so prikazani na sliki 7. Nižji relativni odziv predstavlja višjo učinkovitost eluacije. Med pretokoma 500 in 700 µl/min ni bilo opaziti nobene razlike v učinkovitosti. Za njihov eksperiment so si izbrali pretok 700 µl/min. Slika 7: Odvisnost učinkovitosti eluacije PCB-jev od pretoka puferne raztopine Na koncu so še preučili koncentracijsko odvisnost ekstrakcije v DMSO. Slika 8 prikazuje standardni krivulji. Krogi pripadajo rezultatom ekstrakcije na mikročipu, kvadrati pa pripadajo rezultatom konvencionalne ekstrakcije, ki je služila kot kontrola. Območje merjenja so definirali kot relativni odziv med 10% in 90%, kar pri konvencionalni metodi ustreza koncentracijskemu območju 0.05-5.66 mg/kg, pri mikrofluidni metodi pa 0.04-5.00 mg/kg. Torej bi z mikrofluidno metodo lahko zadostili predpisom za maksimalno vsebnost PCB-jev, ki trenutno znaša 0.5 mg/kg. Z upoštevanjem vseh razredčitev so obogatitveni faktor za mikrofluidno metodo ocenili na 2.69, ki se dobro ujema s teoretično vrednostjo 2.61. S tem so dokazali uporabnost mikrofluidne naprave za ekstrakcijo PCB-jev z DMSO-jem.
Slika 8: Relativni odziv v odvisnosti od koncentracije PCB-jev v olju. Rezultati za mikrofluidno napravo ( ) in konvencionalno metodo ( ). 5. ZAKLJUČEK Znanstveniki so razvili metodo, ki za ekstrakcijo v DMSO uporablja mikrofluidno napravo z mikro vdolbinicam. DMSO, ki je ujet v teh vdolbinicah služi za ekstrakcijo PCB-jev iz olja. Obogatitveni faktor za izolacijsko olje je bil ocenjen na 2.69. Ker te naprave lahko zmanjšajo porabo dragih reagentov, odpravi izparevanje in centrifugiranje, bi jih lahko vgradili v prenosne analizne sisteme s katerimi bi analizo PCB-jev opravili kar na kraju vzorčenja. Čas analize in količina reagentov bi se tako močno zmanjšala, saj bi laboratoriji morali s konvencionalno metodo preveriti samo tiste vzorce, ki bi pri analizi z mikrofluidno napravo dali pozitiven test. 6. VIRI: [1] Arata Aota, Yasumoto Date, Shingo Terakado, Hideo Sugiyama, and Naoya Ohmura; Analysis of Polychlorinated Biphenyls in Transformer Oil by Using Liquid_Liquid Partitioning in a Microfluidic Device. Biotechnology Sector, Central Research Institute of Electric Power Industry, 1646 Abiko, Abiko City, Chiba, 270-1194 Japan. Anal. Chem. 2011, 83, 7834 7840 [2] http://sl.wikipedia.org/wiki/slika:polychlorinated_biphenyl_structure.svg [3] http://en.wikipedia.org/wiki/file:fluorescein_2.svg