Ispitivanje metoda pripreme uzoraka zemljišta za analizu organskih zagađivača

Transcription

1 Univerzitet u Nišu Prirodno-matematički fakultet Departman za hemiju Ispitivanje metoda pripreme uzoraka zemljišta za analizu organskih zagađivača ~ Master rad ~ Mentor: dr Violeta Mitić Student: Jelena Đorđević Niš, 24.

2 Eksperimentalni deo ovog master rada je urađen u labaratorijama Departmana za hemiju Prirodno - matematičkog fakulteta u Nišu. Želim da se zahvalim svojoj mentorki, profesorki dr Violeti Mitić, vanrednom profesoru na Departmanu za hemiju Prirodno - matematičkog fakulteta Univerziteta u Nišu, na ukazanoj pomoći prilikom definisanja teme rada, njenih teorijskih okvira i tokom organizovanja izvođenja eksperimentalnog rada. Takođe, zahvalila bih se i profesorki dr Vesni Stankov Jovanović na savetima i sugestijama pri pisanju rada. Neizmernu zahvalnost dugujem i doktorantima Jeleni Cvetković, Mariji Dimitrijević, Mariji Ilić i Strahinji Simonivuću, na nesebičnoj pomoći prilikom izrade eksperimentalnog dela ovog diplomskog rada. Srdačno se zahvaljujem i svojoj porodici i prijateljima na bezgraničnoj podršci tokom studija i izrade masetr rada.

3 Sadržaj Uvod... I Teorijski deo PAH ovi Hemijske osobine PAH-ova Uticaj PAH-ova na ljudsko zdravlje Metabolizam PAH-ova Validacija analitičkih metoda Specifičnost / selektivnost Linearnost Preciznost Tačnost Granica detekcije / kvantifikacije Robusnost Metode pripreme uzorka Gasna hromatografija (GC) Masena spektrometrija Operacije unutar Triple quadrupole MS Metode snimanja masenih spektara Pregled literature Aparatura Reagensi Pribor Priprema uzoraka Ultrazvučna ekstrakcija QuEChERS ekstrakcija Prečišćavanje uzorka Parametri metode Obrada dobijenih rezultata... 3 III Rezultati i diskusija Sadržaj PAH-ova u uzorcima zemljišta pripremanim ultrazvučnom ekstrakcijom sistemom rastvarača heksan/aceton Sadržaj PAH-ova u uzorcima zemljišta pripremanim ultrazvučnom ekstrakcijom, sistemom rastvarača cikoloheksan/aceton Sadržaj PAH-ova u uzorcima zemljišta pripremanim QuEChERs ekstrakcijom IV Zakljucak V Reference... 5

4 Uvod

5 Tokom 6-tih i 7-tih godina prošlog veka, kao kontaminanti koji nastaju obradom hrane otkriveni su policiklični aromatični ugljovodonici (PAH-ovi). Poslednjih godina vlada veliko interesovanje naučnika za ispitivanje policikličnih aromatičnih ugljovodonika koji svakodnevno utiču na zemljište, vodu, vazduh, biljke i životinje, pa i ljude. Nepoželjni su nusproizvodi u raznim prirodnim i antropogenim procesima. Nalaze se u vazduhu, u vezanom obliku i slobodni. U vodene tokove dospevaju ispuštanjem otpadnih voda, nafte i plina. U zemljištu se nalaze najveće koncentracije PAH-ova. Izvori: fosilna goriva, izduvni gasovi automobila, otpadne vode, otpadni mulj, korišćenje kompozita i đubriva, sušenjem, dimljenjem i prženjem hrane. GC/MS (kombinacija gasna hromatografija/masena spektrometrija) je postala jedan od najmoćnijih instrumenata dostupnih hemičarima kod analize kompleksnih organskih i biohemijskih smeša. Koristi se u analizi hrane, za potrebe sudske medicine (analiza droga i drugih toksičnih jedninjenja), u oblasti toksikologije (identifikacija metabolita lekova), našla je primenu u analizi kancerogenih supstanci iz životne sredine (pesticidi, PAH-ovi) Validacija analitičke metode mora biti izvršena kako bi se osigurala pouzdanost i tačnost analitičkih podataka. Validacija je postupak kojim se dokazuje da metoda služi svrsi za kojoj je namenjena, pa je prvo potrebno definisati svrhu metode, zatim utvrditi postupak i izvoditi eksperiment čiji se rezultati koristie kao dokaz o validnosti metode. Cilj ovog rada je izbor odgovarajuće metode pripreme uzoraka zemljišta koji će biti se koristiti za analizu PAH-ova. Analizirano je 6 PAH-ova čija je kvantifikacija prioritetna po preporukama US EPA (Acenaftilen, Antracen, Benzo[a]antracen, Benzo[a]piren, Benzo[b]fluoranten, Benzo[ghi]perilen, Benzo[k]fluoranten, Krizen, Dibenzo[a,h]antracen, Fluoranten, Fluoren, Indeno[,2,3-cd]piren, Naftalen, Fenantren, Piren, Acenaften). 2

6 I Teorijski deo 3

7 .. PAH ovi Policiklični aromatični ugljovodonici (PAH) su organska jedinjenja koja se sastoje od dva ili više kondenzovana aromatična prstena i veoma su rasprostranjena u životnoj sredini, Nalaze se u nafti, uglju, katranu a nastaju i kao nusproizvodi sagorevanja goriva (bilo fosilnih goriva, bilo biomase) u prisustvu kiseonika. Mogu se naći i u atmosferi, geosferi, hidrosferi itd. Neki od PAH-ova su kancerogeni, mutageni i teratogeni. Nalaze se takođe i u prženoj hrani, pogotovo onoj spremljenoj na visokoj temperaturi kao i u dimljenim proizvodima. Dimljenje je jedna od najstarijih tehnologija čuvanja hrane, koja se zasniva na izlaganju mesa i proizvoda od mesa dimu koji je nastao sagorevanjem drveta. Količine PAH-ova u dimljenim namirnicama zavise od različitih parametara, kao što su sadržaj vlage drveta, temperature sagorevanja drveta i koncentracija kiseonika u komori za sagorevanje drveta (Toth i Blaas, 972). Istraživanja o prodiranju PAH-ova u unutrašnjost dimljenog proizvoda od mesa, pokazuju da se oko 99 posto svih PAH jedinjenja nalaze u spoljašnjem delu uzorka, koji čini 22 posto ukupne mase analiziranog proizvoda kobasice (Jira i sar, 26). Emisija PAH-ova u atmosferu prirodnim putem uključuje i vulkanske erupcije i požare. Na urbanim i industrijskim lokalitetima, PAH-ovi se gotovo u potpunosti emituju ljudskom delatnošću i osnovni su nusprodukti nepotpunog sagorevanja organske materije. Izduvni gasovi automobila predstavljaju najznačajniji izvor emisije PAH-ova u urbanim sredinama. Dizel motori imaju količinski veće čestične emisije u odnosu na vozila sa benzinskim motorima. Pored saobraćaja, važan izvor emisije PAH je industrijska aktivnost kao što je primarna proizvodnja aluminijuma, produkcija koksa, spaljivanje otpada, proizvodnja cementa, rafinerije nafte, petrohemijska industrija, industrija bitumena i asfalta, proizvodnja guma i komercijalna termoelektro produkcija. U zavisnosti od molekulske mase oni se u atmosferi mogu zadržavati ili ne, pa tako se teški PAH-ovi adsorbuju na česticama prašine, dok lakši ostaju u gasovitoj fazi i kasnije se uklanjaju padavinama. PAH-ovi se vazdušnom masom mogu daleko prenositi, a njihova depozicija u kiši ili snegu je značajan izvor zagađenja površinskih voda. Većina PAH-ova dospeva u zemljište putem padavina iz atmosfere. Drugi potencijalni izvori obuhvataju odlaganje otpadnih voda, procednih voda iz koksnih peći kao i korišćenje zemljišnog kompozita i đubriva. Koncentracija PAH-ova u zemljištu se smanjuje dejstvom bakterija i gljivica koje ih pretvaraju u druga organska i neorganska jedinjenja, pri čemu su krajnji proizvodi ugljen dioksid i voda. Neke bakterije ih čak i koriste kao izvor ugljenika pa ih tako dodatno razgrađuju. 4

8 ... Hemijske osobine PAH-ova PAH-ovi su relativno slabo rastvorna jedinjenja u vodi, ali su rastvorni u organskim rastvaračima. Jedinjenja sa većom molekulskom masom su manje rastvorljiva u vodi i manje nestabilna. Baš zbog tih karakteristika više se nalaze u zemljištu nego u vodi i atmosferi. Boja PAH-ova u čvrstom stanju je bela, žuta, bledo zelena, ali mogu biti i bezbojni, PAH-ovi imaju karakteristične UV spektre, otporni su na fotorazgradnju i u pobuđenom stanju mogu da fluoresciraju. Imaju kondenzovane aromatične prstenove koji ne sadrže heteroatome niti sadrže supstituente. Po IUPAC-u najprostiji PAH-ovi su fenantren i antracen, koji imaju tri aromatična jezgra, dok se manji molekuli kao npr, benzen ne smatraju za PAH jedinjenja. Najčešće se javljaju PAH-ovi sa pet ili šest aromatičnih jezgra. PAH-ovi sastavljeni od šestočlanih prstenova nazivaju se alternativnim PAH-ovima, dok se neki iz te grupe nazivaju benzenoidnim PAHovima, čije ime naravno potiče od benzena aromatičnog šestočlanog prstena. PAH-ovi se sastoje iz aromatičnih prstenova koji su međusobno povezani jednostukom ugljenik-ugljenik vezom. PAH-ovi koji sadrže do šest aromatičnih prstenova nazivaju se malim PAH-ovima, dok oni koji sadrže više od šest su veliki PAH-ovi. Zbog dostupnosti uzoraka malih PAH-ova, istraživanja se uglavnom vrše na njima. Biološka aktivnost i postojanje velikih PAH-ova je manja zbog kinetičkog ograničenja usled dodavanja uzastopnih prstenova. Iako veliki PAHovi imaju veći broj izomera, postojanje specifičnih izomera je malo. Rastvorljivost se smanjuje za otprilike jedan stepen sa svakim dodatim prstenom. Naftalen se sastoji iz dva koplanarna šestočlana prstena koja imaju zajedničku stranicu. On se po IUPAC-u ne smatra za pravim PAH-om iako je biciklični aromatični ugljovodonik. Slika : Naftalen Primeri nekih PAH-ova koji se najčešće javljaju u zemljištu i koji su prioritetni po US EPA (ukupno 6 sa naftalenom) (European Commision, 25,)prikazani su u tabeli : 5

9 Tabela : EU prioritetni policiklični aromatični ugljovodonici Naziv Strukturna formula Molekulska formula Molekulska masa Naftalen C H 8 28 Acenaftilen C 2 H 8 52 Acenaften C 2 H 54 Fluoren C 3 H 66 Fenantren C 4 H 78 Antracen C 4 H 78 Fluoranten C 6 H 22 6

10 Piren C 6 H 22 Benzo[a]antracen C 8 H Krizen C 8 H Benzo[b]fluoranten C 2 H Benzo[k]fluoranten C 2 H Benzo[a]piren C 2 H

11 Indeno[,2,3- cd]piren C 22 H Dibenzo[a,h]antracen C 22 H Benzo[ghi]perilen C 22 H Velike količine PAH-ova mogu biti sorbovane od strane organske materije u zemljištu. Sa porastom molekulske mase PAH-ova, raste stepen sorpcije, usled povećanja lipofilnosti. Određeni PAH-ovi male molekulske mase se gube vremenom usled isparavanja, degradacije i izluživanja...2. Uticaj PAH-ova na ljudsko zdravlje PAH-ovi u zavisnosti od strukture mogu biti netoksični do izrazito toksični, Npr, benzo[a]piren je prvo otkriveno kancerogeno jedinjenje u duvanskom dimu. EPA (Larsen, 22) je klasifikovala PAH-ove u šest grupa koje su kancerogene za ljude: benzo[a]piren, benzo[b]fluoranten, benzo[k]fluoranten, krizen, dibenz(a,h)antracen, i indeno(,2,3-cd)piren. PAH-ovi koji su poznati po svojim kancerogenim, teratogenim i mutagenim svojstvima su: benzo[a]antracen i krizen, benzo[b]fluoranten, benzo[j]fluoranten, benzo[k]fluoranten, benzo[a]piren, benzo[ghi]perilen, koronen, dibenzo(a,h)antracen, indeno(,2,3-cd)piren, i ovalen. Oni izazivaju rak pluća, jednjaka, želuca, debelog creva, mokraćnog mehura, kože i prostate. U većoj meri su im izloženi pušači. Profesionalno su izloženi radnici koji rade sa asfaltom, koksom, u proizvodnji aluminijuma, gvožđa i čelika. 8

12 PAH-ovi se vrlo lako mogu da inhaliraju a potom i adsorbuju u plućima i crevima. Ovako adsorbovani PAH-ovi se mogu putem krvi da prošire kroz ceo organizam, izazivajući imunotoksičnost, teratogenost, različite oblike karcinoma, arteriosklerozu, i još mnoga druga oboljenja. Takođe, vrlo štetan uticaj koji PAH-ovi mogu da prouzrokuju je oštećenje DNA što za posledicu ima različite vrste i oblike mutacija. Regulativa Komisije Evropske unije br. 88/26 propisuje maksimalno dozvoljene količine benzo[a]pirena u različitim grupama namirnica, 6 US EPA prioritetna PAH jedinjenja su: Acenaftilen, Antracen, Benzo[a]antracen (BaA), Benzo[a]piren (BaP), Benzo[b]fluoranten (BbF), Benzo[ghi]perilen (BgP), Benzo[k]fluoranten (BkF), Krizen (CHR), Dibenzo[a,h]antracen (DhA), Fluoranten, Fluoren, Indeno[,2,3-cd]piren (IcP), Naftalen, Fenantren, Piren, Acenaften. Toksični ekvivalentni faktor (TEF vrednost) se, uglavnom, koristi za procenu kancerogenog potencijala određenih policikličnih aromatičnih ugljovodonika i izražava se u odnosu na karcinogenost benzo[a]pirena (Nisbet i LaGoy, 992; Boström i sar,, 22,). Vršena su ispitivanja na miševima i njihovim fetusima: ingestija velike količine benzo[a]pirena u trudnoći rezultovala je teškoćama u reprodukciji. Ovo dejstvo je uočeno i na potomcima. Kao posledica su se javili i deformiteti pri rođenju kao i povećana telesna masa. Ne zna se da li se ove posledice javljaju i kod ljudi. (Department of Health, Government of South Australia, 29,). Vršena su i istraživanja na ljudima: uzeti su uzorci mleka, posteljice kao i krv pupčanika i analizirani izabrani PAH-ovi. Najviši nivo benzo[a]pirena, dibenz[a,c]antracena i krizena su zabeleženi u mleku i krvi pupčanika, ali su u polovini uzoraka PAH-ovi bili prisutni u koncentracijama vrlo malo iznad granice detekcije. Ipak, autori su zaključili da koncentracija PAH-ova i kod fetusa i kod odojčadi zavisi od ishrane majke (Larsen, 22,). Kod majki koje puše duvan, uočeno je da PAH ovi mogu proći kroz placentu i dospeti u telo nerođenčeta (Department of Health, Government of South Australia, 29). PAH-ovi se preko krvi distribuiraju u tkivima, zbog svog nepolarnog karaktera posebno u onim sa visokim sadržajem masti. Pošto im se metabolizmom povećava polarnost lakše se izlučuju iz organizma. Smatra se da su metilovani derivati PAH-ova toksičniji od nesupstituisanih jedinjenja. Teorija koja opisuje toksičnost PAH-ova ( the bay theory ) objašnjava veću reaktivnost PAHova u formi zaliva od PAH-ova u formi fjorda (slika 2) (Weis, 998,). Zaliv Fjord Slika 2. Strukture zaliva i fjorda 9

13 Kancer se javlja usled vezivanja PAH-ova za DNA. Ćelije koje su najviše podložne uticaju ovih jedinjenja su koštana srž, koža i pluća, krvne ćelije i imuni sistem, mozak, reproduktivni organi. Akutno izlaganje PAH-ovima dovodi do glavobolje, oštećenja kože, mučnine i respiratornih smetnji, dok hronična izloženost izaziva bronhitis, rak pluća, bubrega i usne duplje, leukemiju...3. Metabolizam PAH-ova Nakon ulaska u ljudsko telo, PAH-ovi podležu nizu oksidacionih biotransformacija pri čemu se pretvaraju u niz metabolita (slika 3): U Fazi I PAH-ovi se oksiduju enzimima citohroma P45 pri čemu nastaju visokoreaktivni epoksidni intermedijeri koji se onda redukuju ili hidrolizuju uz pomoć enzima epoksid hidroksilaze u OH-PAH-ove. PAH-ovi se mogu i direktno hidrolizovati bez formiranja epoksidnog intermedijera, U Fazi II OH-PAH-metaboliti se konjuguju sa glutationom, glukuronskom kiselinom ili sulfatom kako bi se olakšala detoksikacija, i pri čemu dolazi do izlucivanja putem urina, ali se tokom godina deo akumulira u organizmu, Slika 3. Oksidaciona biotransformacija PAH-ova

14 Kao krajnji metabolit benz[a]pirena nastaje 7,8 -dihidrodiol-9,-epoksid benz[a]pirena koji je njegov najtoksičniji metabolit. On se vezuje za DNA i RNA. Izrazito je kancerogen. Izaziva veću mutagenost u odnosu na druge metabolite benz[a]pirena..2. Validacija analitičkih metoda Validacija je postupak kojim se dokazuje da metoda služi svrsi kojoj je namenjena, a zahteva je i zakonska regulativa i analitička profesija. Validaciju treba sprovesti: - pri razvoju i uvođenju nove metode - pri promeni bilo kojeg dela analitičke metode koja je već bila validirana promena postojeće metode poboljšanje i prilagođavanje postojeće metode prenošenje metode u drugu laboratoriju prenošenje metode na drugi instrument promene u sintezi glavne komponente, sastavu gotovog proizvoda ili analitičkom postupku Prvo je potrebno definisati svrhu metode. Zatim se utvrđuje postupak rada, izvode eksperimenti i prikupljaju rezultati koji dokazuju validnost metode. Postoje osam osnovnih parametara validacije jedne analitičke metode:. Specifičnost / selektivnost 2. Linearnost 3. Analitički opseg metode (Radno područje) 4. Preciznost - Ponovljivost (eng, repeatability) - Međupreciznost (eng, Intermediate precision) - Reproduktivnost(eng,reproducibility) 5. Tačnost (recavery vrednost) 6. Granica kvantifikacije 7. Granica detekcije 8. Robusnost.2.. Specifičnost / selektivnost Je svojstvo metode da tačno i specifično odredi željeni analit u pristvu ostalih komponenata u matriksu uzorka pod utvrđenim uslovima ispitivanja. Iako se u praksi često poistovjećuju, specifičnost i selektivnost su dva različita svojstva metode. Specifična metoda je ona kojom se može odrediti samo jedan specifični analit. Metoda kojom se može određivati više

15 komponenata istovremeno, ali pod uslovima da te komponente pri određivanju ne smetaju jedna drugoj naziva se selektivnom. Kod hromatografskih metoda, osim upoređivanja hromatograma referentnog materijala i uzorka, potrebno je dokumentovati i parametre koji određuju razdvojenost i simetriju pikova, a kod određenih metoda i prikupiti dokaze o čistoći pikova Linearnost Je mogućnost metode da unutar određenog područja daje rezultate proporcionalne koncentraciji analita u uzorku. U praksi se linearnost određuje merenjem odziva metode na različite poznate koncentracije referentnog materijala (preporučuje se najmanje pet različitih koncentracija uz tri ponavljanja). Linearnost metode se procenjuje matematički i grafički. Matematički način procene se vrši na taj način što se primenom linearne regresije izrazi jednačina pravca (y = ax + b) i izračuna koeficijent korelacije (k). Nagib pravca (a) je parametar koji ukazuje na osetljivost metode. Što je veća vrednost nagiba pravca, metoda je osetljivija. Odsečak pravca (b) može da ukaže na sistematsku grešku. Načešće korišćena forma linearne regresije je bazirana na tri pretpostavke: -svaka razlika između eksperimentalnih podataka i izračunate regresione linije dovodi do neodređenih grešaka koje utiču na vrednost y -ove neodređene greške imaju normalnu distribuciju -neodređene greške su iste za sve standarde, svaki standard doprinosi podjednako u dobijanju nagiba i odsečka Kao rezultat regresione i korelacione analize moguće je izračunavanje koeficijenta korelacije (k). Kriterijum koji se postavlja prilikom validacije metode podrazumeva da je vrednost koeficijenta korelacije k,99. U slučaju izuzetno niskih koncentracija analita, prihvata se i kriterijum k,98. Grafičke metode koje prikazuju zavisnost analitičkog signala od koncentracije analita omogućavaju vizuelnu procenu (slika 4): Slika 4: Dva načina grafičkog prikaza linearnosti 2

16 .2.3. Analitički opseg metode (Radno područje) Je interval između gornje i donje koncentracijske granice analita (granice su uključene) u uzorku, unutar kojeg analitički postupak ima zadovoljavajuću preciznost, tačnost i linearnost. Za određivanje tog parametra nije potrebno izvođenje posebnih eksperimenata, nego se zaključci izvode iz studije linearnosti. Raspon koncentracija treba da odgovara stvarnom uzorku, ali treba i da uključi koncentraciju na granici kvantifikacije kada je ona bitna Preciznost Predstavlja meru slaganja između niza merenja istog homogenog uzorka izvedenih pod propisanim uslovima. Važno je naglasiti da se eksperimenti preciznosti rade na homogenom autentičnom uzorku, a postupak se ponavlja prema propisu kojim će se kasnije raditi u praksi. Preciznost se izražava kao: -Ponovljivost (Repeatability) - podudaranje rezultata dobijenih uzastopnim merenjem istog uzorka istom metodom pod istim uslovima (isti analitičar, isti instrument, ista laboratorija u kratkom vremenskom razdoblju) -Srednja preciznost (Intermediate precision) - odstupanje rezultata dobijenih merenjem istog uzorka istom metodom pod različitim uslovima u istoj laboratoriji (različit analitičar, različit instrument, reagensi različitih dobavljača, duži period) -Reproduktivnost - podudaranje rezultata dobijenih uzastopnim merenjem nekoliko istih uzorka istom metodom u različitim laboratorijima (različit analitičar, različiti radni uslovi unutar specificiranih parametara metode) Preciznost se eksperimentalno kvantifikuje vrednošću greške metode, a numerički pokazatelji toga su standardna devijacija, koeficijent varijacije i varijanca. s = n i= ( x x) i n S-standardna devijacija x i - pojedinačni sadržaj svake probe, dobiven određivanjem -srednja vrednost određivanja 2 s KV (%) = x S-standardna devijacija -srednja vrednost određivanja n ( ) xi x 2 i= s = n S 2 - varijanca x i - pojedinačni sadržaj svake probe, dobiven određivanjem n broj određivanja -srednja vrednost određivanja 2 Eksperimenti određivanja preciznosti se vrše na homogenom analitičkom uzorku, tj veštački pripremljenom uzorku, dok se postupak određivanja sprovodi po metodi koja će se 3

17 ubuduće raditi u praksi. Broj ponavljanja treba da zadovolji zahteve statistike. Najčešće se rade po tri ponavljanja na nekoliko koncentracija koje se nalaze u opsegu linarnosti. Kao alternativa, za potvrdu preciznosti mogu da se upotrebe rezultati određivanja najmanje devet proba na najmanje tri koncentraciona nivoa tretiranih radi provere tačnosti metode. Izračuna se sadržaj analita u svim probama, a zatim se dobijeni rezultati obrade statistički. Izračuna se srednja vrednost sadržaja, standardna devijacija i relativna standardna devijacija Tačnost (Recovery vrednost) Predstavlja meru usaglašenosti eksperimentalno dobijenih rezultata predloženom metodom sa pravim (stvarnim) vrednostima, odnosno ona ukazuje na ispravnost merenja. Procena tačnosti često se naziva i Recovery eksperiment. Izražava se kao procenat prinosa. Tačnost metode se proverava: - Analizom standardnih referentnih materijala - Određivanjem procenta prinosa ili tzv. recovery vrednosti - Upoređivanjem sa metodom koja je potvrđena kao tačna standardna metoda Tačnost metode se eksperimentalno proverava na sledeći način: -Najpre se odmeri dovoljno istovetnih slepih proba, a zatim se dodavanjem različitih količina standardne supstance analita, formiraju najmanje tri koncentraciona nivoa sa po najmanje tri probe: prvi nivo sa manjom količinom analita od specifikovane, drugi nivo sa količinom analita kao specifikovane u ispitivanom uzorku treći nivo sa većom količinom analita od specifikovane, - Zatim se primenom metode koja se validira, uradi kvantitativna analiza svih proba, - Izračuna se sadržaj analita u svakoj probi, - Na kraju se za svaku probu izračuna tzv. recovery vrednost, prema sledećem izrazu Gde je: x i pojedinačni sadržaj svake probe, dobiven određivanjem μ i tačna (dodata) vrednost analita u svakoj probi 4

18 Na slici 5 su prikazani pojmovi preciznosti i tačnosti: Slika 5: prikaz preciznosti i tačnosti određivanja.2.6. Granica detekcije / kvantifikacije Granica detekcije se još naziva i Limit detekcije (LOD). To je granica dokazivanja ili detekcije (eng. Limit of Detection - LOD), odnosno najmanja moguća koncentracija analita koja se može detektovati, ali ne i kvantitativno odrediti. Određivanje limita detekcije moguće je vršiti statistički ili vizuelno. Izračunavanje očekivanog teorijskog limita detekcije statistički se vrši primenom regresione analize funkcije dobijene za linearnost. Iz izračunate vrednosti nagiba (b) regresione prave i standardne devijacije (S) funkcije linearnosti, izračunava se teorijski limit detekcije prema formuli: Zbog interferencija koje je nemoguće potpuno otkloniti, eksperimentalno se određuje realni limit detekcije na sledeći način: - Najpre se odmere najmanje tri istovetne slepe probe pa se u njih dodaju različite količine standardne supstance analita: - prva proba sa količinom analita jednakom izračunatom limitu detekcije, - druga proba sa dvostruko većom količinom analita od izračunatog limita detekcije, 5

19 - treća proba sa trostruko većom količinom analita od izračunatog limita detekcije, - Zatim se primenom metode koja se validira uradi kvantitativna analiza svih proba, - Na bazi signala svih proba, limit detekcije se izračunava kao realna koncentracija analita koja bi dala signal tri puta veći od standardne devijacije signala slepe probe tj, šuma bazne linije. Granica kvantifikacije se naziva i Limit kvantifikacije (LOQ) i predstavlja granicu kvatitativnosti (eng. Limit of Quantification - LOQ), tj. najmanju moguću koncentraciju analita koja se može odrediti uz dozvoljenu grešku. Određivanje limita kvantifikacije sprovodi se u dve faze: - U prvoj fazi se izračuna očekivani teorijski limit detekcije primenom regresione analize funkcije dobijene za linearnost. Iz izračunate vrednosti nagiba (b) regresione prave i standardne devijacije (S) funkcije linearnosti, izračunava se teorijski limit kvantifikacije (LOQ), prema formuli: - Takođe, očekivani limit kvantifikacije može da se izračuna eksperimentalno kao koncentracija analita koja bi dala signal deset puta veći od standardne devijacije slepe probe, dobijene merenjem šuma bazne linije Robusnost Robusnost analitičke metode je mera njene sposobnosti da se odupre malim i namernim promenama u parametrima metode, a ujedno je i mera pouzdanosti metode tokom rutinske primene. Robusnost se može smatrati delom validacije metode koji se izvodi na kraju razvoja metode ili na početku validacije. Robusnost metode se procenjuje variranjem jednog faktora dok ostali ostaju nepromenjeni. Na taj način se identifikuju faktori koji utiču na metodu, te je analitičar u stanju da definiše uslove koji moraju da se strogo kontrolišu tokom primene metode. Ciljevi procene robusnosti metode su sledeći: -procena kvantitativnosti metode -određivanje limita za procenu pogodnosti sistema Koraci u proceni robusnosti: - izbor faktora koji će se testirani, - definisanje nivoa faktora, - izbor eksperimentalnog dizajna, - definisanje eksperimentalnog protokola, - definisanje odgovora koji će se pratiti, - izvođenje eksperimenta i određivanje odgovora metode, - izračunavanje efekata, - statistička i/ili grafička analiza efekata i - izvođenje zaključaka iz statističke analize 6

20 Stabilnost analita i celog sistema se eksperimentalno proverava na sledeći način: - U prvoj fazi se primenom metode koja se validira uradi kvantitativna analiza najmanje tri probe iz istog homogenog uzorka, - Pripremljeni radni rastvori se izmere sa najmanje trostrukim očitavanjem na odgovarajućem aparatu, - Iz dobijenih analitičkih signala standardnih rastvora izračuna se sadržaj analita. U drugoj fazi se svi pripremljeni radni rastvori, posle isteka izabranog vremenskog intervala, na isti način ponovo izmere na istom aparatu. Stabilnost se procenjuje, ali ne i ograničava, na period od 48 sati, pri čemu uslovi čuvanja radnih rastvora moraju biti definisani. - Opet se zabeleže signali standardnih rastvora i ponovo izračuna sadržaj analita, - Zatim se uporede signali standardnih rastvora i izračunati sadržaji analita u ponovljenom merenju (P2) u odnosu na prvo merenje (P) i izračuna procenat promene, prema sledećoj formuli: Kao alternativa, za proveru stabilnosti analita i sistema mogu da se mere radni rastvori koji se pripremaju radi provere preciznosti ili tačnosti metode. 7

21 .3. Metode pripreme uzorka Radi prečišćavanja uzorka zemljišta mogu se koristiti različite metode: ultrazvučna ekstrakcija smešom rastvarača, Soxhletova ekstrakcija, mikrotalasna ekstrakcija, ekstrakcija organskim rastvaračima na koloni, ekstrakcija superkritičnim fluidima, mikroekstrakcija čvrstom fazom. Ultrazvučna ekstrakcija smešom rastvarača: ultrazvuk visoke snage koji se ovde koristi omogućava veće prodiranje rastvora u materijal (K. Joa i sar, 29,). Preporučuje se da se uzorci koji sadrže manje koncentracije PAH-ova ekstrahuju najmanje dva puta, uvek svežom porcijom rastvarača. Od rastvarača je najbolje primeniti smešu aceton/metilen hlorid (:, v/v) ili aceton/heksan (:, v/v). Ultrazvučna ekstrakcija omogućava delotvorniju ekstrakciju od klasične ekstrakcije tečno/tečno i Soxhlet-ove ekstrakcije. Prednosti postupka ultrazvučne ekstrakcije su njena relativna brzina, jednostavnost, ubrzani prenos mase i to što ne zahteva skupe instrumente, a nedostaci velika zapremina rastvarača koja se koristi i potreba da se ekstrakcija ponovi više puta. Ekstrakti se nakon završene ekstrakcije moraju filtrirati. Soxhletova ekstrakcija je najčešće primenjivana za ekstrakciju isparljivih i slabo isparljivih organskih jedinjenja iz čvrstih uzoraka. Uzorak se smešta u celuloznu čauru ekstrakcija se vrši kontinualno, uvek dodatkom sveže porcije rastvarača. Ekstrakcija se vrši na temperaturi ispod tačke ključanja rastvarača brzinom od 4-6 ciklusa na sat u vremenskom intervalu od 6-24 časa. Tečna ekstrakcija pod pritiskom (Accelerated solvent extraction, Pressurized fluid extraction) je jedna od novijih tehnika ekstrakcije, koja se za ekstrakciju PAH-ova primenjuje od devedesetih godina prošlog veka (Popp i sar, 997; Saim i sar, 998,). Uzorak i rastvarač se ubacuju u ekstrakcionu ćeliju i ona se zatvara. Nakon toga, uzorak se tretira na povišenoj temperaturi i pod pritiskom, 5- minuta, pa se rastvarač odstranjuje iz sistema. Mikrotalasna ekstrakcija koristi mikrotalase kao izvor zagrevanja smeše uzorakrastvarač (Eskilson i Bjorkland, 2,). Obično se biraju oni rastvarači koji apsorbuju mikrotalase. Velika prednost ove tehnike je što primenom mikrotalasne ekstrakcije ne dolazi do degradacije uzorka. 8

22 .4. Gasna hromatografija (GC) Gasna hromatografija je metoda razdvajanja i detekcije lako isparljivih organskih jedinjenja i nekih neorganskih gasova iz smeše (aditivi, degradacioni produkti polimera ). Mobilna faza, gas nosač koji nosi komponente smeše kroz kolonu, je u gasovitom stanju, a stacionarna faza može biti tečna ili čvrsta. Uzorak se pre uvođenja u kolonu mora prevesti u gasovito stanje. GC ima brojne prednosti: veoma je osetljiva metoda ( -5 g), određivanja se izvode veoma brzo, potrebne su male količine uzorka za ispitivanje ( ml) i ima mogućnost povezivanja sa MS. Metoda pokazuje i izvesne nedostatke: ispitivana jedinjenja moraju biti u gasovitom agregatnom stanju tako da usled visoke temperatute (>3 C) kojoj je kolona izložena može doći do isparavanja same kolone kao i do degradacije uzorka, Princip gasno hromatografske analize se zasniva na prolasku smeše (koja je nošena gasom nosačem) kroz kolonu u kojoj se vrši razdvajanje uzorka na komponente u zavisnosti od njihovih fizičkih i hemijskih osobina. Identifikacija komponenti smeše se vrši na osnovu retencionog vremena (vreme zadržavanja svake komponente na stacionarnoj fazi). Na kraju kolone je detektor koji registruje odvojene komponente i prevodi ih u električni signal koje prikazuje u vidu hromatograma. Brzina prolaska uzorka kroz kolonu se određuje temperaturom kolone u peći podešavanjem brzine prolaska nosećeg gasa (flow rate). Gasni hromatografa prikazan na slici 6 se sastoji iz sledećih delova: - boca sa nosećim gasom i regulatorom pritiska (izvor gasa nosača), - injektorski sistem (za unošenje uzorka u kolonu), - termostat (za održavanje konstantne temperature), - hromatografska kolona (za razdvajanje komponenata smeše), - detektor (detektuje komponente istim redosledom kojim one napuštaju kolonu), - sistem za registrovanje signala iz detektora monitor ili štampač, Gas nosač (He, Ar, N 2, H 2 ): mora da bude hemijski inertan i čist. Izbor gasa zavisi od analizirane supstance i detektora, Veoma je važna regulacija pritiska i protoka gasa jer utiču na efikasnost razdvajanja. Kolone mogu biti u obliku kruga, spirale, slova U; metalne, staklene ili plastične. Razdvajanje zavisi od dužine i širine kolone (što je kolona duža i uža razdvajanje je bolje). Kolone se pune silika gelom, zeolitom, aluminijum oksidom, aktivnim ugljem, u zavisnosti od prirode analiziranog uzorka. Optimalna temperatura kolone bi trebala da bude nešto viša od temperature ključanja komponente čija je Tk najveća. 9

23 Slika 6: Delovi gasnog hromatograma Detektori: koriste se različite vrste detektora. Najviše se koriste termo provodljivi detektori (TCD) i plameno jonizacioni (FID), Oni imaju primenu u širokom opsegu koncentracije za različita organska jedinjenja. Može se koristiti i maseni spektrometar..5. Masena spektrometrija Masena spekrometrija je fizičko-hemijska metoda koja se zasniiva na jonizaciji ispitivanog uzorka, kao i razlaganju nastalog jonskog snopa na jone različitog odnosa masa/naelektrisanje (m/z). Masena spektrometrija se može kombinovati sa drugim metodama kako bi se povećale njihove performanse, najčešće sa gasnom i tečnom hromatografijom. Kompleksne smeše se mogu veoma lako razdvojiti gasnom hromatografijom. Masena spekrometrija se koristi za identifikaciju individualnih komponenata, jer maseni spektar daje informacije o njihovoj strukturi. Pojedinačne komponente smeše se pojavljuju na gasnom hromatogramu u vidu zasebnih pikova. Retenciono vreme može poslužiti kao veličina za kvalitativno definisanje, ali ovo nije pouzdan način, pa se nikako ne sme koristiti za određivanje sastava nepoznatih i ranije neidentifikovanih jedinjenja. Ono što je veoma bitno za GC MS je da obe tehnike koriste približno istu količinu uzorka u gasovitom stanju (manje od ng). Gasni hromatograf se može direktno vezati za maseni spekrometar. U sistemu GC MS koriste se različiti sistemi za injektovanje, kolone, gasovi nosači, jonski izvori i maseni analizatori. Tokom analize dobija se 2

24 veliki broj podataka, koji se ne mogu obraditi ručno, pa je neophodno povezivanje instrumenata sa računarskim sistemom. Opšta šema aparature prikazana je na slici 7, pri čemu su brojevima označeni sledeći delovi:. boca sa gasom nosačem 2. injektor (sistem za unošenje uzoraka) 3. kapilarna kolona 4. veza između GC i MS 5. jonski izvor 6. maseni analizator 7. detektor 8. vakuum sistem 9. računar Slika 7: Šema aparature za GC-MS Uloga jonskog izvora je da molekule uzorka fragmentiše u jone i da formira i ubrza nastali jonski snop koji se kreće ka masenom analizatoru. S obzirom na to da je većina jonizatora dizajnirana za rad sa gasovima, molekuli se najpre prevode u gasovito stanje. U slučaju da uzorci u gasovitom stanju imaju visok napon pare, neophodno je da se unose direktno u jonski izvor. Tečnosti i čvrste materije se obično prethodno zagrevaju, da bi im se povećao napon pare za analizu. Uobičajene jonizacione tehnike koje se danas koriste su: - Jonizacija elektronima (EI electron ionization) najčešće korišćena - Hemijska jonizacija (CI chemical ionization) - Bombardovanje brzim atomima i (FAB fast atom bombardment) 2

25 - Jonizacija potpomognuta laserskom desorpcijom iz matriksa (MALDI Matrix Assisted Laser Desorption Ionization) Maseni analizator ima dvostruki zadatak: da odvoji jone mase m od jona slične mase m+δm i da nakon toga fokusira izdvojeni snop jona. Ovo se ostvaruje pod dejstvom električnih i magnetnih polja. Neki od analizatora koji se koriste su jonski trap, analizator na bazi vremena preletanja, ali se najčešće koristi kvadrupolni analizator. On se sastoji iz 4 metalne šipke od kojih su 2 vezane za pozitivni izvor, a 2 za negativni. Između njih se formira dvodimenzionalno radiofrekventno polje. Samo rezonantni joni (joni sa konstantnom putanjom) čiji se pravac kretanja poklapa sa pravcem oscilovanja radiofrekventnog polja, dolaze do detektora. Ostali joni koji su nerezonantni, ne dolaze do detektora. Na slici 8 je data šema kvadrupolnog analizatora. Slika 8: Šema kvadrupolnog analizatora Kada se jonske vrste razdvoje u masenom analizatoru potrebno ih je kvalitativno i kvantitativno odrediti. Detekcija se najčešće izvodi električnim putem, tako što se meri abundanca ukupna jonska struja. Maseni spektrometar radi u uslovima visokog vakuuma, pritiska reda veličine -5 do -7 mbar. Ovakve uslove obezbeđuju dve pumpe: mehanička (za grubo vakuumiranje sistema) i pumpa visokog pritiska. Vakuum uklanja čestice nosećeg gasa i sve nejonizovane ili nefragmentisane molekule uzorka. Najsavremeniji aparat Agilent 7 series Triple Quadrupole GC/MS je korišćen za snimanje uzoraka u ovom radu. To je jedina tripl kvadrupol GC/MS kombinacija, koji ima heksapolnu kolizionu ćeliju ispunjenu kombinacijom azota i helijuma, radi poboljšanja fragmentacije pre konačne filtracije i kvantifikacije. 22

26 .5.. Operacije unutar Triple quadrupole MS Joni se transportuju iz jonskog izvora do prvog kvadrupola (slika 9): Slika 9: Šema TQ MS U analizatoru se između 4 paralelne šipke određeni joni filtriraju. Nakon prolaska kroz prvi kvadrupol, filtrirani joni ulaze u kolizionu ćeliju u kojoj se fragmentišu. Koliziona ćelija se obično naziva drugim kvadrupolom, ali u ovom slučaju ona zapravo predstavlja heksapol ispunjen azotom ili drugim kolizionim gasom. Joni fragmenti nastali joniyacijom odabranih jona u kolizionoj ćeliji, dalje se šalju do trećeg kvadrupola, za drugi stadijum filtracije, radi izdvajanja i ispitivanja mogućnosti višestrukih prekursora za identifikaciju i kvantifikaciju ciljnog molekula. Na kraju, joni koji prolaze kroz treći kvadrupol se detektuju pomoću visokoenergetskog detektora (slika ). Slika : Delovi detektora 23

27 Detektor je visoko energetska dinoda kuplovana sa elektronskim multiplikatorom. Visoko energetska dinoda se nalazi van ose centra prednjeg kvadrupolnog analizatora. Orijentacija smanjuje mogućnost neutralnih molekula da dođu do detektora, dok u isto vreme privlači jone visokim potencijalom. Kada jonski snop udari dinodu, joni se konvertuju u elektrone pre udara u multiplikator. Ovi elektroni su privučeni ka pozitivnijem kraju elektronskog multiplikatora. Ovakva orijentacija detektora omogućava neutralnim atomima da prođu i da budu eliminisani od strane vakuum sistema Metode snimanja masenih spektara Postoje dve metode snimanja uzoraka: SIM (Selected ion monitoring) metoda prate se samo odabrani joni i MRM (multiple reaction monitoring) metoda - posmatranje višestrukih reakcija. SIM metoda se koristi u kvantitativnim određivanjima, Pre njene upotrebe, da bi se postigli optimalni uslovi, mora se izvesti anliza SCAN metodom (snimanje kompletnog masenog spektra). SIM tehnikom detektuju se vrednosti m/z samo reprezentativnih jona posmatranog molekula. Vreme praćenja jona je veće pa se samim tim povećava i osetljivost čak od do puta. Karakteristični joni, vreme početka snimanja (start time) i vreme praćenja jona (dwell time) biraju se na osnovu podataka dobijenih pomoću SCAN tehnike. MRM metoda se može izvoditi jedino sa TQ MS. U ovom načinu rada, prednji analizator radi u SIM režimu, izdvajajući određeni jon ili grupu jona karakterističnih m/z vrednosti. Nakon filtracije u prvom kvadrupolu, očekuje se da će samo joni sa tačno određenom m/z vrednošću proći dalje. Nakon fragmentacije u kolizionoj ćeliji, treći kvadrupol takođe radi u SIM režimu za određeni opseg m/z vrednosti, radi hvatanja produkt jona nastalih iz prekursora. 24

28 .6. Pregled literature S obzirom da su PAH-ovi veoma prisutni u životnoj sredini, naučna javnost se često bavi njihovim ispitivanjem. Kao metoda analize najčešće se koristi upravo kombinacija gasne hromatografije i masene spektrometrije. Tabela 2: Karakterizacija PAH-ova sa različitog područija (Nam i sar., 23) U radu Distribution of polycyclic aromatic hydrocarbons in agricultural soils in South Korea (Nam i sar., 23,) korišćena je Soxhletova ekstrakcija kao način pripreme uzorka, Kvantitativna analiza je rađena uz pomoć GC-MS tehnike: korišćena silika kapilarna kolona (DB 5 ms, 3 m x,25 mm ID x,25 μl, J&W Sci, INC, USA) i helijum kao noseći gas sa konstantnom brzinom uduvavanja od 4 cm/s. Program je započeo zagrevanjem sistema na temperaturu 75 ºC, održavana temperatura 5 minuta a zatim povećana na 5 ºC, po 25 ºC po minuti a zatim na 265 ºC, po 4 ºC po minuti. Finalna temperatura je održavana minuta a zatim povećana na 285 ºC, μl uzorka je injektovan u splitless modu. Dobijeni rezultati koncentracije ukupnih PAH-ova u zavisnosti od geomorfološke lokacije je prikazana u tabeli 2, iz koje se vidi da se najveće koncentracije PAH-ova javljaju u oblastima gde se prerađuje gvožđe. U radu Global patterns of polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs) in soil, (Wilcke, 27,) prikazani su rezultati analize uzoraka pripremanih različitim metodama ekstrakcije: metanolna saponifikacija sa KOH, ultrazvučna ekstrakcija, Soxhletova ekstrakcija sa smešom rastvarača heksan:aceton (2:,v/v), ekstrakcija pod pritiskom, ekstrakcija sa smešom rastvarača heksan:aceton (2:,v/v) u aparatu Accelerated Solvent Extractor (Dionex ASE 2, Dionex,Co, Sunnyvale, CA). Za određivanje PAH-ova korišćen je Hewlett Packard 589 series II sa masenim detektorom Hewlett Packard 597, u SIM modu uz pomoć jonskog izvora sa elektronskom jonizacijom (EI). Korišćena je kapilarna kolona od silika gela (3x,25x,25 μm) i helijum kao noseći gas (konstantan pritisak, 8 kpa). Temperatura injektovanja podešena je na 3 ºC i detektora 32 ºC. Primenjeno je splitless injektovanje. 25

29 Slika : koncentracije 2 ispitivanih PAH-ova(Wilcke, 27) Na slici su prikazane koncentracije svih 2 ispitivanih PAH-ova. Ispitano je 225 uzoraka iz 2 različitih geografskih regija. U zemljištu sa niskim koncentracijama svih 2 PAHova koji su ispitivani, dominantni su naftalen, fenantren i perilen. U zemljištima sa visokom koncentracijom ovih 2 PAH-ova, dominantno je PAH-ova sa velikom molekulskom masom. Najveće koncentracije PAH-ova su prisutne u industrijskim oblastima u Nemačkoj, a najmanja koncentracija je u zemljištu koje je uzorkovano iz šuma Amazona u Brazilu. U radu Levels of PAHs in soil and vegetation samples from Tarragona County, Spain, (Nadal i sar., 24,) prikazani su rezultati određivanja PAH-ova u uzorcima koji su ekstrahovani u Soxhletovoj aparaturi sa 3 ml smeše rastvarača heksan/dihlormetan (:,v/v). Uzorci su analizirani uz pomoć GC (Agilent 689, Wilmington, DE, USA), opremljen kapilarnom kolonom od silica gela (HP-5; 3 m dužine,,25 mm i.d.,,25 μm debljine). Temperatura injektovanja bila je 8 ºC a temperatura detektora 325 ºC. Izabran je splitless metod i helijum kao noseći gas (7,8 ml/min). Ispitane su koncentracije PAH-ova u zemljištu i vegetaciji. Uzorci su skupljani u urbanim sredinama i u nezagađenim delovima. Rezultati su prikazani u tabeli 3: Tabela 3: koncentracije PAH-ova u različitim sredinama (Nadal i sar., 24,) 26

30 Eksperimentalni deo 27

31 2.. Aparatura - Triple Quadrupole GC/MS system Agilent 7 Series - Vaga - Shimadzu AX2 - Ultrazvucno kupatilo J.P.Selectra, s.a. Barselona, Spain - Aparatura za Soxletovu ekstrakciju - Vodeno kupatilo - Baths HH-S4 - Vakuum uparivac, IKA RV 5 basic Werke - Aparat za dejonizovanu vodu - TKA MICROMED 2.2. Reagensi - PAH standardi Kit 6-N Supelco, Bellefonte, Pennsylvania, čvrsta supstanca, koji sadrži: acenaftilen, antracen, benzo[a]antracen, benzo[a]piren, benzo[b]fluoranten, benzo[ghi]perilen, benzo[k]fluoranten, krizen (93%), dibenzo[a,h]antracen, fluoranten, fluoren, indeno[,2,3-cd]piren, naftalen, fenantren, piren, acenaften - Deuterisani Supelco, Bellefonte, Pennsylvania, čvrsta supstanca: krizen d, acenaften d - Surogat deuterisani Standard Mix 4mg/ml Supelco, Bellefonte, Pennsylvania, čvrsta supstanca, koji sadrži: 2-hlorfenol-3,4,5,6-d 4,,2-dihlorbenzen-d 4, 2- fluorbifenil, 2-fluorfenol, nitrobenzen-d 5, fenol-d 6, p-terfenil-d 4, 2,4,6-tribromofenol - Silika gel Macherey - Nagel Germany; veličina pora:,63-,2 mm; 7 23 mesh ASTM - Al 2 O 3 Merck; veličina pora:,63-,2 mm; 7 23 mesh ASTM - Dihlormetan - for HPLC, gradient grade, SIGMA-ALDRICH - n - Heksan - Fluka, Spain, for HPLC - Aceton - for HPLC, gradient grade, SIGMA-ALDRICH 2.3. Pribor - erlenmajer sa čepom - kvantittativni levak - balon sa okruglim dnom - kiveta za centrifugu - vijale za GC - automatska pipeta - menzura - normalni sudovi - kleme, mufovi, stativi, prsten za levak 28

32 2.4. Priprema uzoraka U ovom radu korišćene su ultrazvučna i 4,2, QuEChERS ekstrakcija, kao metode pripreme uzorka Ultrazvučna ekstrakcija Odmeno je 5 g uzorka zemljišta, preneto u erlenmajer sa zapušačem i preliveno sa 5 ml smeše rastvarača heksan / aceton u odnosu :. Nakon toga vršena je ekstrakcija 3 puta po 5 minuta na ultrazvučnom kupatilu, pri čemu je pre svake nove ekstrakcije dodavano po 5 ml smeše rastvarača. Kako bi se povećala efikasnost ekstrakcije, posle druge ekstrakcije izvršeno je ceđenje ekstrahovanog sistema, a uzorku zemljišta koji je ostao u erlenmajeru dodavano je novih 5 ml smeše rastvarača. Nakon završene ekstrakcije, proceđen ekstrakt je uparen do suva na vakuum uparivaču, na 4 C. Nakon uparavanja vršeno je rastvaranje ostatka i na taj način pripremano 5 ml svakog od ispitivanih uzoraka. Kivete u kojima su pripremljeni uzorci neophodno je dobro zatvoriti kako uzorci ne bi isparili QuEChERS ekstrakcija QuEChERS je skraćenica za veoma koristan analitički pristup koji znatno pojednastavljuje analizu u komleksim uzorcima. QuEChERS procedura podrazumeva nekoliko jednostavnih analitičkih koraka koji se lako obavljaju i malo su osetljivi na greške. Takođe obezbeđuje visok prinos ekstrakcije za veliki broj PAH ova, a krajnji ekstrakt se može direktno analizirati GC ili LC hromatografijom. Procedura QuEChERS ekstrakcije sastoji se u sledećem - odmerena količina uzoraka (5g prosejane zemlje) prenese se u kivetu za centrifugiranje (5ml), doda se 5 ml dejonizovane vode, energično promućka, potom se dodaje rastvarač za ekstrakciju (acetonitril) i dobro promućka. Nakon ovoga, dodaje se sadržaj QUECHERS pack a (4g MgSO 4 i g NaCl), meša se energično. Nakon ovog postupka centrifugira se min na 35 rpm Prečišćavanje uzorka U kivetu u kojoj se nalazi 5 ml ekstrakta dodato je 25 mg PSA (koji predstavlja primarni, sekundarni amin, za prečišćavanje) i 5 mg Al 2 O 3 (5%). Kivete su energično mućkane 5 minuta, a zatim je izvršeno centrifugiranje u trajanju od minuta pri brzini od 8 obrtaja u 29

33 minuti. Nakon završenog centrifugiranja pažljivo je prenešeno,6 ml ekstrakta u vijalu za GC snimanja u SIM modu Kalibracione prave U kivete koje sadrže PSA i Al 2 O 3 (5%) dodavano je 5,, 25 i 5 μl standardnog rastvora čija je koncentracija 69,5 μg/ml i 95, 9, 75 i 5 μl ekstrakta slepe probe pripremane na tri načina (ultrazvučna ekstrakcija heksan/aceton, ultrazvučna ekstrakcija cikloheksan/aceton, QuEChERS ekstrakcija). Zatim je dodato po 2 μl unutrašnjeg standarda čija je koncentracija 8 μg/ml kao i po μl surogat standarda koncentracije μg/ml. Kivete su energično mućkane5 minuta, a zatim centrifugifugirane minuta pri brzini od 8 obrtaja u minuti. Nakon završenog centrifugiranja preneto je,6ml ekstrakta u vijalu za GC snimanja u SIM metodu. Na taj način dobijene su kalibracione prave za određivanje PAH-ova uzoraka pripremljenih na tri načina (ultrazvučna ekstrakcija heksan/aceton, ultrazvučna ekstrakcija cikloheksan/aceton, QuEChERS ekstrakcija) Parametri metode Snimanje serije standardnih rastvora i uzoraka rađeno je u SIM modu. U tabeli 4 su dati parametri metode: Tebela 4: parametri metode za SIM mod Zapremina koja se injektuje Temperaturni režim Vreme trajanja procesa Mod Pritisak Ukupni protok Kolona- vrsta Dimenzije kolone Protok Prosečna brzina 5 μl Inicijalno 3 min/75 ºC, temperaturni gradijent 6 ºC /min do 3 C, održavano min 5,5 min splitless 5,44 psi 54 ml/min HP-5MS 5% Phenyl Methyl Siloxan 3 m x 25 μm x,25 μm ml/min 23,67 cm/sec 2.8. Obrada dobijenih rezultata Za obradu dobijenih rezultata analize korišćen je program Mass Hunter. Nakon otvaranja programa iz File sekcije odabrati radnju New Batch i iz foldera odabrati željenu datoteku i imenovati je. Nakon toga iz sekcije File/Add Sample odabrati željene uzorke za analizu i odrediti njihov Level (koncentraciju, gde je L5 najkoncentrovaniji rastvor iz standardne serije). Zatim se postavlja nova metoda tako što se odabere standardni rastvor sa najvećom koncentracijom (pikovi imaju najveći intenzitet te se sa sigurnošću smatra da će se sve 3

34 željene komponente videti na hromatogramu), čekiranjem kvadratića, a zatim se odabere Method/Edit. Zatim se bira Method Setup Task/Retention Time Setup gde se vrše podešavanja vezana za retenciona vremena svake komponente (slika 2): slika 2: Retenciona vremena Iz sekcije Method Setup Task/ISTD Setup odabere se odgovarajući unutrašnji standard - acenaften d i krizen d2 (bira se standard koji ima sličnu strukturu kao i analizirani PAH) i u odeljku ISTD Concentration unese njegova koncentracija (slika 3): 3

35 slika 3: Odabir unutrašnjeg standarda U sekciji Method task/calibration curve setup, čekira se FORCE kako bi grafik prošao kroz nulu. Da bi se izvršila kalibracija u odeljku Method/Create Levels from Calibration Samples za seriju standardnih rastvora potrebno je podesiti željene koncentracije standarda. U slučaju da neki od standarda imaju istu koncentraciju može se izvršiti kopiranje vrednosti koncentracija odabirom jedinjenja sa istim koncentracijama u odeljku Method/Copy Calibration Levels to. Ukoliko su uneti svi potrebni podaci, nova metoda može da bude validirana i sačuvana odabirom opcije Validate iz sekcije Save/Exit. Podešavanje integratora vrši se u odeljku Method/Edit/Method Tasks/Advanced Task. Za sve uzorke podesiti MS MS metod integracije i zapamtiti podešavanje (slika 4): 32

36 slika 4: Podešavanje integratora Analiza serije rezultata vrši se klikom na dugme Analyze Batch, dok se čuvanje podataka postiže odabirom komande Save Batch iz File sekcije (slika 5). slika 5: Analiza i čuvanje rezultata Ovako dobijeni rezultati se dalje mogu koristiti i obrađivati. 33

37 III Rezultati i diskusija 34

38 Cilj ovog rada je izbor odgovarajuće metode pripreme uzoraka zemljišta za analizu PAHova. Analizirano je 6 PAH-ova koji su prioritetni po EU standardima (Acenaftilen, Antracen, Benzo[a]antracen, Benzo[a]piren, Benzo[b]fluoranten, Benzo[ghi]perilen, Benzo[k]fluoranten, Krizen, Dibenzo[a,h]antracen, Fluoranten, Fluoren, Indeno[,2,3-cd]piren, Naftalen, Fenantren, Piren, Acenaften). Kao metode za pripremu uzoraka, u cilju njihove ekstrakcije korišćena je ultrazvučna ekstrakcija sa smešom rastvarača heksan/aceton, ultrazvučna ekstrakcija sa smešom rastvarača cikloheksan/aceton i disperzivna ekstrakcija čvrstom fazom (QuEChERS), a kvantifikacija izvršena primenom GC-MS analizesnimanjem u SIM modu. 3.. Sadržaj PAH-ova u uzorcima zemljišta pripremanim ultrazvučnom ekstrakcijom sistemom rastvarača heksan/aceton Hromatogrami uzorka i standardnih rastvora pripremljenih ultrazvučnom ekstrakcijom u sistemu heksan/aceton dobijeni snimanjem u SIM modu dati su na slikama 6 2: x 6 +EI TIC SIM P.d Counts vs. Acquisition Time (min) Slika 6: Hromatogram slepe probe pripremljene ultrazvučnom ekstrakcijom (heksan/aceton) x 6 +EI TIC SIM P2.d Counts vs. Acquisition Time (min) Slika 7: Hromatogram standarda pripremljenog ultrazvučnom ekstrakcijom (heksan/aceton) 35