Izolacija rdečih pigmentov iz paprike s plini visoke gostote

Transcription

1 Tadej Ojsteršek Izolacija rdečih pigmentov iz paprike s plini visoke gostote Diplomsko delo Maribor, september 2014

2 Diplomsko delo univerzitetnega študijskega programa I. stopnje Študent: Študijski program: Predvideni strokovni naslov: Mentor: Komentor: Tadej Ojsteršek univerzitetni študijski program I. stopnje Kemijska tehnologija diplomirani inženir kemijske tehnologije (UN) red. prof. dr. Željko Knez red. prof. dr. Mojca Škerget Maribor, september 2014

3

4 IZJAVA Izjavljam, da sem diplomsko delo izdelal sam, prispevki drugih so posebej označeni. Pregledal sem literaturo s področja diplomskega dela po naslednjih geslih: Vir: Google Scholar ( Gesla: Število referenc Supercritical IN Extraction 4 Extraction IN of Chili Pepper 8 Carotenoids 1 Vir: Wikipedia ( Gesla: Število referenc Chili Pepper 7 Electromagnetic IN Spectrum 2 Carotenoids 4 Skupno število pregledanih člankov: 34 Skupno število pregledanih knjig: 4 Maribor, september 2014 Tadej Ojsteršek I

5 Zahvala Zahvaljujem se Dariji Cör ter ostalim članom Laboratorija za separacijske procese in produktno tehniko za podporo in pomoč pri eksperimentalnem delu, mentorju Željku Knezu in somentorici Mojci Škerget za pregled diplomskega dela ter staršem, ki so mi s prispevki in podporo omogočili študij. Diplomo posvečam nedavno preminulemu dedku Avguštinu. II

6 Izolacija rdečih pigmentov iz paprike s plini visoke gostote Povzetek Diplomsko delo prikazuje različne ekstrakcijske metode, s katerimi smo ekstrahirali pigmente iz rdeče čili paprike. Kot topili smo uporabili superkritični CO2 in subkritični propan. Ekstrakcije so potekale pri različnih temperaturah in tlakih, prav tako pa smo za primerjavo izvedli še ekstrakcijo s Soxhletovim aparatom, pri kateri smo kot topilo uporabili petroleter. Velikost zmletih delcev semen in rastlinskega tkiva smo določili s sejalno analizo. Z UV-VIS spektrofotometrom smo pripravljenim vzorcem določili absorbanco ter nato izračunali barvno intenziteto dobljenih ekstraktov po CU (Colour Unit) vrednosti. Rezultati kažejo, da je najprimernejša metoda za izolacijo pigmentov iz paprike superkritična ekstrakcija s CO2, za izolacijo kapsaicina pa ekstrakcija s subkritičnim propanom. Ključne besede: Ekstrakcije, superkritični fluidi, Soxhletov aparat, sejalna analiza, UV-VIS spektrofotometrija UDK: : (043.2) III

7 Isolation of Red Pigments From Chilli Pepper With High-Density Gases Abstract In this thesis, different extraction methods, with which the pigments from red chili pepper were extracted, are presented. Supercritical carbon dioxide and subcritical propane were used as solvents. Extractions were performed on different temperature and pressure conditions. For comparision, the extraction with Soxhlet extractor, where petroleum ether was used as a solvent, was also performed. Sieve analysis of ground material was performed in order to define the size of the particles of the raw material in seeds and plant tissue. Additionally, the UV-VIS spectrophotometry was performed in order to measure absorbance with which the colour intensity in CU (Color Unit) values was calculated. The results show that the supercritical extraction with carbon dioxide is the most suitable method to isolate pigments and the extraction with subcritical propane is the most suitable method to isolate capsaicin from red chili pepper. Key words: Extractions, supercritical fluids, Soxhlet extractor, sieve analysis, UV-VIS spectrophotometry UDK: : (043.2) IV

8 Kazalo 1 Uvod Teoretični del Rdeča čili paprika Superkritični fluidi Ekstrakcija Ekstrakcija trdno-tekoče (leaching) Superkritična ekstrakcija Drobljenje in mletje Sejanje UV-VIS spektrofotometrija Ekstrakcija paprike Eksperimentalni del (metode dela, aparature) Materiali Ekstrakcija s superkritičnim CO Ekstrakcija s subkritičnim propanom Ekstrakcija s petroletrom v Soxhletovem aparatu Sejalna analiza UV-VIS spektrofotometrija Rezultati in diskusija Semena Rastlinsko tkivo Primerjava med semeni in rastlinskim tkivom Zaključek Literatura Življenjepis V

9 Seznam tabel Tabela 2-1: Vsebnost hranilnih snovi v rdeči čili papriki na 100 g živila... 3 Tabela 2-2: Lastnosti superkritičnih fluidov v primerjavi s plini in tekočinami... 4 Tabela 2-3: Podatki o kritičnih temperaturah in tlakih nekaterih snovi... 5 Tabela 2-4: Poraba energije v odvisnosti od finoče drobljenja Tabela 4-1: Vrednosti gostot ogljikovega dioksida pri različnih temperaturah in tlakih VI

10 Seznam slik Slika 2-1: Plodovi rdeče čili paprike... 2 Slika 2-2: Notranjost ploda rdeče čili paprike s semeni... 2 Slika 2-3: Diagram tlak - temperatura za čisto snov... 4 Slika 2-4: p-t diagram za ogljikov dioksid s premicami konstantne gostote... 5 Slika 2-5: Poenostavljen shematski prikaz procesa ekstrakcije trdno-tekoče... 7 Slika 2-6: Izoterme topnosti v odvisnosti od tlaka pri superkritični ekstrakciji... 8 Slika 2-7: Integralna sejalna krivulja Slika 2-8: Diferencialna sejalna krivulja Slika 2-9: Spekter elektromagnetnega valovanja Slika 2-10: Poenostavljena shema UV-VIS spektrofotometra Slika 2-11: Kapsaicinoidi in sorodne spojine v rdeči čili papriki Slika 2-12: Kemijska struktura luteina Slika 2-13: Kemijska struktura β-karotena Slika 2-14: Kemijska struktura kapsantina Slika 2-15: Kemijska struktura zeaksantina Slika 3-1: Shema laboratorijske aparature za superkritično ekstrakcijo s CO Slika 3-2: Skica Soxhletovega aparata Slika 3-3: Shema sejalnega vibracijskega stroja Slika 4-1: Ekstrakcijske krivulje semen rdeče paprike za superkritično ekstrakcijo s CO2 pri 40 C Slika 4-2: Ekstrakcijske krivulje semen rdeče paprike za superkritično ekstrakcijo s CO2 pri 60 C Slika 4-3: Izkoristek ekstrakcije semen rdeče paprike v odvisnosti od gostote ogljikovega dioksida Slika 4-4: Ekstrakcijske krivulje semen rdeče paprike za ekstrakcijo s subkritičnim propanom Slika 4-5: Integralna sejalna krivulja za semena Slika 4-6: Diferencialna sejalna krivulja za semena Slika 4-7: Vrednosti obarvanosti pri ekstraktih semen po ekstrakciji s superkritičnim CO Slika 4-8: Vrednosti obarvanosti pri ekstraktih semen po ekstrakciji s subkritičnim propanom Slika 4-9: Ekstrakcijski krivulji rastlinskega tkiva rdeče paprike za superkritično ekstrakcijo s CO Slika 4-10: Ekstrakcijske krivulje rastlinskega tkiva rdeče paprike za ekstrakcijo s subkritičnim propanom Slika 4-11: Integralna sejalna krivulja za rastlinsko tkivo Slika 4-12: Diferencialna sejalna krivulja za rastlinsko tkivo Slika 4-13: Vrednosti obarvanosti pri ekstraktih rastlinskega tkiva po ekstrakciji s superkritičnim CO Slika 4-14: Vrednosti obarvanosti pri ekstraktih rastlinskega tkiva po ekstrakciji s subkritičnim propanom Slika 4-15: Število izvedenih ciklov pri ekstrakcijah s Soxhletovim aparatom VII

11 Slika 4-16: Izkoristek pri ekstrakcijah s Soxhletovim aparatom Slika 4-17: Vrednosti barvne moči pri vhodnem materialu, topilo aceton VIII

12 Uporabljeni simboli in kratice A absorbanca (-) CU barvna intenziteta oz. obarvanost ekstrakta (Colour Unit) (-) d d (R50) d (R25) d (R75) velikost najpogosteje zastopanega zrna (mm) velikost medianskega zrna (mm) velikost zrna pri R=25% na integracijski sejalni krivulji (mm) velikost zrna pri R=75% na integracijski sejalni krivulji (mm) D delež presevka na integracijski sejalni krivulji (%) D difuzivnost (m 2 /s) k koeficient zrnatosti (-) m (CO2) mekstr M (CO2) pc pz masa ogljikovega dioksida (g) masa ekstrakta (g) molska masa ogljikovega dioksida (g/mol) kritični tlak (bar) zunanji tlak oz. tlak okolice (kpa) R delež ostanka na sitih na integracijski sejalni krivulji (%) R splošna plinska konstanta (J K -1 mol -1 ) S/F Tc Tz ekstrakcijsko razmerje med maso topila in maso topljenca (solvent-to-feed) (kg/kg) kritična temperatura ( C) zunanja temperatura oz. temperatura okolice (K) V (CO2) volumen ogljikovega dioksida (dm 3 ) Grški simboli η viskoznost snovi (kg/ms) ρ gostota snovi (kg/m 3 ) Kratice ASTA SCF UV/VIS American Spice Trade Association (Ameriško združenje za trgovino z začimbami) superkritični fluid ultravijolični/vidni spekter elektromagnetnega valovanja IX

13 1 Uvod Rdeča čili paprika je v svetovni prehrambeni industriji ena izmed najpogosteje uporabljenih začimb in nepogrešljiv del predvsem mehiške in madžarske nacionalne kuhinje, v zadnjem času pa so bile izvedene mnoge raziskave tudi na področju njene uporabnosti v medicini, farmaciji in barvni industriji. [1] Pri tem pomemben del predstavlja tudi kemijska industrija, ki s pomočjo procesa ekstrakcije z različnimi topili omogoči izolacijo zdravilne učinkovine kapsaicina in njegovih sorodnih spojin kapsaicinoidov ter naravnih barvil, ki so po kemijski sestavi večinoma karotenoidi. [2][3] Namen tega diplomskega dela je preučiti in izvesti različne vrste ekstrakcij, predvsem superkritične ekstrakcije pri visokih tlakih in ekstrakcije trdno-tekoče pri normalnih tlakih. Z različnimi ekstrakcijskimi metodami smo želeli ekstrahirati barvne pigmente iz rdeče čili paprike ter pri tem preučiti vpliv temperature in tlaka na izkoristek oz. dobit ekstrakcije. Kot topila smo uporabili superkritični CO2, subkritični propan in petroleter. Spoznali smo se z aparaturo za ekstrakcijo s sub- in superkritičnimi fluidi ter Soxhletovim aparatom za ekstrakcijo trdno-tekoče. Velikost zmletih delcev semen in rastlinskega tkiva, ki smo jih predhodno zdrobili v kavnem mlinčku, smo določili s sejalno analizo. Z UV-VIS spektrofotometrom smo pripravljenim vzorcem določili absorbanco ter nato izračunali barvno intenziteto dobljenih ekstraktov po CU (Colour Unit) vrednosti. Na podlagi vseh analiz smo lahko primerjali različne vrste ekstrakcij med seboj. Proučevali smo različne pozitivne in negativne vidike uporabe posameznega topila ter vrst ekstrakcij. Na podlagi tega smo lahko v zaključku določili najprimernejše metode za uporabo v kemijski industriji. Diplomsko delo obsega: teoretični del s predstavitvijo rdeče čili paprike in opisano teorijo superkritičnih fluidov, ekstrakcij, drobljenja in mletja, sejanja in UV-VIS spektrofotometrije. Posega na področja termodinamike, separacijske in mehanske tehnike ter analizne in organske kemije, pri opisu rdeče čili paprike tudi na področja izven kemije in kemijske tehnologije, eksperimentalni del z opisi aparatur in metod, ki so bile izvedene v laboratoriju, rezultate z diskusijo, zaključek, seznam uporabljene literature, življenjepis. 1

14 2 Teoretični del 2. 1 Rdeča čili paprika Rdeča čili paprika (znanstveno ime Capsicum annuum) je rastlina enoletnica iz družine razhudnikovk in rodu paprik. Po svojih bioloških značilnostih spada med kritosemenke in dvokaličnice. Njen rdeč plod, prikazan na sliki 2-1, v svoji notranjosti vsebuje številna semena (slika 2-2), ki služijo razmnoževanju rastline. [4] Slika 2-1: Plodovi rdeče čili paprike [5] Slika 2-2: Notranjost ploda rdeče čili paprike s semeni [6] Izvira z območja Južne in Srednje Amerike, od koder so jo v Evropo in ostali svet prvi prinesli španski raziskovalci nekaj let po Kolumbovem odkritju Amerike leta Zgodovinski viri [7] omenjajo, da jo je v Evropo leta 1493 prvi prinesel Diego Álvarez Chanca, fizik z druge Kolumbove odprave v Novi svet, po zaslugi preostalih španskih, portugalskih, nizozemskih, francoskih in angleških pomorščakov pa je do konca 16. stoletja to rastlino spoznal ves dotlej poznani svet. V današnjih časih je največja pridelovalka, potrošnica in izvoznica rdeče čili paprike Indija, ki je po ocenah strokovnjakov v letu 2003 pridelala približno milijon ton te vrste paprike, od tega je približno desetino svojega pridelka izvozila v tuje države. [8] 2

15 Snovi, ki dajejo značilen okus in ostrino rdeči čili papriki, so kapsaicin (8-metil N vanilil 6 nonenamid) in njegove sorodne spojine, imenovane kapsaicinoidi. Ob zaužitju paprike se te snovi vežejo na bolečinske receptorje (nociceptorje) v ustih in grlu, ki se odzivajo na toplotne dražljaje. Ko se ti receptorji aktivirajo s pomočjo kapsaicinoidov, pošljejo sporočilo možganom, da je človek zaužil nekaj vročega, možgani pa na to občutje odgovorijo s povišanim srčnim utripom, povišano stopnjo potenja in izločanjem hormonov endorfinov, opiatom sorodnih kemijskih spojin, ki ublažijo nastalo bolečino in izboljšajo človeško razpoloženje. [1] Zaradi svoje značilne ostrine in pikantnosti, pri čemer je stopnja ostrine pri rdeči čili papriki po Scovillovi lestvici vsaj 20-krat višja kot pri navadni [9], se njen plod zelo pogosto uporablja v kulinariki po celem svetu, predvsem na Madžarskem (paprikaš) in v Mehiki, kjer si značilnih nacionalnih jedi brez te začimbe skorajda ne znajo predstavljati. Pred uporabo plod navadno osušijo in mu s tem podaljšajo rok uporabnosti. Ker vsebuje večjo koncentracijo kapsaicina kot navadna paprika, je pogost vir izoliranega kapsaicina, ki se v medicini uporablja kot varen in učinkovit analgetik (protibolečinsko zdravilo) proti sklepnemu artritisu, pasovcu (herpes zostru), diabetični nevropatiji in glavobolu. Zaradi svojega učinka na ljudi in živali se v večjih količinah lahko uporabi kot neubojno kemično orožje (»peper sprej«) ter kot obrambno sredstvo proti napadom nekaterih sesalcev na ptičja gnezda in vrtni pridelek, pri čemer v svetu prednjači njegova kmetijska uporaba za obrambo pridelkov pred sloni v Afriki in Aziji. Na bolečinske receptorje ptičev kapsaicin ne deluje tako kot na tiste od sesalcev, kar pomeni, da lahko jedo plodove rdeče čili paprike v večjih količinah in imajo s tem pomembno vlogo pri njenem razmnoževanju, saj ob zaužitju plodov njena semena raztrosijo na tla in jih po naravni poti kasneje dodatno izločijo cele (njihov prebavni trakt jih ne poškoduje). [1] Kot živilo vsebuje velike količine vitamina C (ob isti masi živila vsebuje skoraj trikratno vrednost koncentracije vitamina C pri pomaranči ali limoni) [10] in nekoliko manjšo količino β-karotena, provitamina A. Je tudi dober vir vitaminov B, predvsem vitamina B6, in kovin kalija, magnezija in železa. Tabela 2-1 prikazuje vsebnost hranilnih snovi v rdeči čili papriki na 100 g živila: Tabela 2-1: Vsebnost hranilnih snovi v rdeči čili papriki na 100 g živila [1] Hranilna snov Ogljikovi hidrati Maščobe Beljakovine β-karoten Vitamin B6 Vitamin C Železo (Fe) Magnezij (Mg) Kalij (K) Voda Kapsaicin masa na 100 g živila 8,8 g 0,4 g 1,9 g 534 μg 510 μg 144 mg 1 mg 23 mg 322 mg 88 g 0,01 g 6 g 3

16 2. 2 Superkritični fluidi O superkritičnem fluidu (skrajšano SCF) govorimo, kadar imamo snov pri pogojih, pri katerih sta temperatura in tlak oba nad vrednostima kritične temperature in kritičnega tlaka te snovi (T > Tc in p > pc). [11] To območje ponazarja slika 2-3: Slika 2-3: Diagram tlak - temperatura za čisto snov [11] Lastnosti topil pri superkritičnih pogojih združujejo lastnosti topil v tekočem (njihova gostota je reda velikosti gostote tekočin) in plinastem stanju (njihova viskoznost je reda velikosti plinov), medtem ko je njihova difuzivnost nižja od difuzivnosti plinov in višja od difuzivnosti tekočin, kar prikazuje tabela 2-2: Tabela 2-2: Lastnosti superkritičnih fluidov v primerjavi s plini in tekočinami [11] Plin Superkrit. fluid Tekočina ρ (kg/m 3 ) 1 0, D (m 2 /s) η (kg/ms) Zvišanje gostote fluida ponavadi omogoča povečanje topnosti topljenca v njem, medtem ko njihova manjša viskoznost v primerjavi s tekočinami omogoča boljše transportne lastnosti. Osnovna lastnost SCF, ki zaradi svojih lastnosti predstavljajo širok potencial v separacijskih procesih, je možnost spreminjanja lastnosti superkritičnega topila v okolici kritične točke z 4

17 majhnimi spremembami temperature in/ali tlaka. Slika 2-4 prikazuje diagram tlaktemperatura za ogljikov dioksid s premicami konstantne gostote: Slika 2-4: p-t diagram za ogljikov dioksid s premicami konstantne gostote [11] Majhne spremembe temperature in/ali tlaka povzročijo veliko spremembo gostote superkritičnega topila in s tem različne medsebojne topnosti v sistemih z ostalimi snovmi. V tabeli 2-3 so zbrani podatki o kritičnih točkah nekaterih spojin, ki se uporabljajo kot SCF: Tabela 2-3: Podatki o kritičnih temperaturah in tlakih nekaterih snovi [11] Tc ( C) pc (bar) Ogljikov dioksid (CO2) 31 73,8 Voda (H2O) ,0 Propan (C3H8) 97 42,4 Amoniak (NH3) ,0 Cikloheksan (C6H12) ,2 Metan (CH4) ,0 Aceton (CH3COCH3) ,0 5

18 2. 3 Ekstrakcija Ekstrakcija je postopek, s katerim iz trdnih ali tekočih zmesi s pomočjo topila odstranjujemo v tem topilu topne komponente. Sestoji iz dveh zaporednih operacij. V prvi spravimo zmes v intenziven stik s topilom, v drugi nato obe fazi ločimo. Vrste ekstrakcij so solventna ekstrakcija (tekoče-tekoče), ekstrakcija trdno-tekoče (leaching) in superkritična ekstrakcija (večinoma trdno-scf, lahko tudi tekoče-scf). Ekstrakcija s subkritičnim fluidom (utekočinjenim plinom) je vrsta ekstrakcije trdno-tekoče, izvedene pri visokem tlaku, ki je lahko višji od kritičnega, vendar pri temperaturi, nižji od kritične. [11] Ekstrakcija trdno-tekoče (leaching) Ekstrakcija trdno-tekoče je vrsta ekstrakcije, pri kateri s pomočjo tekočega topila odstranjujemo v tem topilu topne komponente iz trdnih snovi. Postopek uporabljamo za pridobivanje olj iz plodov in semen ter za pridobivanje arom, začimb in farmacevtskih substanc iz rastlin in sadežev. Kot topilo večinoma uporabljamo hlapna organska nepolarna topila, v nekaterih primerih (npr. ekstrakcija sladkorja iz sladkorne pese) pa tudi vodo in ostala polarna topila. Če je topljenec v trdni snovi enakomerno porazdeljen, poteka raztapljanje najprej na površini, nato pa mora topilo prodreti skozi zunanji sloj trdne snovi v njeno notranjost, preden doseže topljenec, zaradi česar se hitrost ekstrakcije zmanjša. V splošnem lahko proces razdelimo v tri stopnje: [11] 1. fazna sprememba pri raztapljanju topljenca, 2. difuzija topljenca v topilu, ki se nahaja v porah trdnega materiala, na površino delca, 3. prenos topljenca skozi tekočinski film s površine delca v glavni tok topila. Katerakoli teh stopenj lahko omejuje ekstrakcijsko hitrost, vendar prvi proces fazne spremembe praviloma poteče tako hitro, da je njegov vpliv na ekstrakcijsko hitrost zanemarljiv. V primeru ekstrakcije olja iz semen je topljenec tekočina in lahko difundira skozi pore na površino delca, kjer pride v stik s topilom. Dejavniki, ki vplivajo na hitrost ekstrakcije trdno-tekoče, so naslednji: [11] Velikost delcev Čim manjša je velikost, tem večja je medfazna površina med trdnim materialom in tekočino, zato je prenos snovi hitrejši. Po drugi strani pa lahko zelo fini delci ovirajo separacijo delcev in fluida ter se lahko sprimejo v večje delce, posledično s tem ovirajo pretok tekočine. V splošnem se naj bi izogibali zelo majhnim delcem, željeno pa je, da je območje velikostne porazdelitve delcev čim manjše. Topilo Njegova izbira je zelo pomembna; izbrati moramo selektivno topilo z nizko viskoznostjo. Med ekstrakcijo koncentracija topljenca v topilu narašča, ekstrakcijska hitrost pa pada zaradi zmanjšanja koncentracijskega gradienta in naraščanja viskoznosti raztopine. Temperatura V večini primerov topnost komponente, ki jo ekstrahiramo, narašča s temperaturo, zato narašča ekstrakcijska hitrost, prav tako z njo narašča difuzijski koeficient. V nekaterih primerih je njena zgornja meja določena sekundarno, denimo z aktivnostjo encima ali ekonomičnostjo procesa. 6

19 Mešanje fluida Poveča snovni prenos s površine materiala v glavno maso topila, prav tako preprečuje sedimentacijo delcev. V primeru, ko je topljenec porazdeljen po trdni snovi, ki je neprepustna za topilo, moramo material zdrobiti, da je ves topljenec izpostavljen topilu. V tem primeru ima mletje odločujoč vpliv ne le na hitrost ekstrakcije, temveč tudi na njem dobit oz. izkoristek. Če ima trdna snov celično strukturo, je ekstrakcijska hitrost praviloma majhna, saj celične stene predstavljajo dodaten upor. V praksi ekstrakcijski proces trdno-tekoče vključuje tri operacije: [11] 1. raztapljanje topnih komponent v topilu, 2. ločitev raztopine od netopnega trdnega preostanka, 3. izpiranje trdnega preostanka, da odstranimo ostanke raztopine, adherirane na trdno snov. Celoten postopek predstavlja poenostavljen shematski procesa ekstrakcije trdnih substanc na sliki 2-5: Slika 2-5: Poenostavljen shematski prikaz procesa ekstrakcije trdno-tekoče [11] 7

20 Superkritična ekstrakcija Superkritični fluidi predstavljajo širok potencial v ekstrakcijskih procesih, saj je njihovo delovanje na material zaradi visoke gostote podobno kot pri tekočinah, njihova separacija od ekstrakta pa mnogo enostavnejša kot pri tekočem topilu. Za to namreč zadostuje le znižanje tlaka ali prehod na zunanjo temperaturo in tlak, pri čemer pride do uparevanja SCF, ki pri normalnih sobnih pogojih ob drastično znižani gostoti kot plin ni več topen v materialu in ekstraktu ter se s tem po hitrem postopku iz mešanice izloči sam. [11] Tudi v sistemu topljenec-scf je topnost odvisna od narave in fizikalno-kemijskih lastnosti topljenca na eni ter topila na drugi strani. Nanjo vpliva več dejavnikov, med fizikalnimi sta najpomembnejša tlak in temperatura. Z računskimi metodami, ki temeljijo na termodinamskih izračunih fugativnosti, topnostnih parametrov in virialnih koeficientov, poskušamo topnost direktno povezati s tlakom in temperaturo, vendar te enačbe običajno ne zmorejo opisati topnosti različnih snovi v SCF v širokih območjih tlaka in temperature, poleg tega je v mnogih primerih ocena konstant v enačbah zelo težavna ali nemogoča. [11] Splošni pravili, ki določata topnost substanc v SCF, sta: s povečanjem gostote pri konstantni temperaturi se povečuje topnostna kapaciteta fluida, s poviševanjem temperature pri določeni gostoti se povečuje topnost snovi v SCF. Z naraščanjem tlaka pri konstantni temperaturi narašča gostota topila. Razdalja med molekulami topila se manjša, s tem se povečajo specifične interakcije med molekulami topljenca in topila. Temperatura vpliva na parni tlak topljenca in gostoto topila. Pri nizkih tlakih že z majhnim naraščanjem temperature gostota topila hitro pade. Ker v tem območju prevladuje vpliv gostote, topnost z naraščanjem temperature pada. Pri višjih tlakih je gostota precej manj odvisna od temperature, zato topnost z višanjem temperature narašča zaradi naraščanja parnega tlaka topljenca. [11] Napisano ponazarja slika 2-6: Slika 2-6: Izoterme topnosti v odvisnosti od tlaka pri superkritični ekstrakciji [11] 8

21 Zaradi relativno nizkih vrednosti kritične temperature in tlaka (31 C in 73,8 bar), posledično pa tudi nižje porabe energije za dosego superkritičnih pogojev, se kot topilo pri superkritičnih ekstrakcijah najpogosteje uporablja ogljikov dioksid (CO2). Za topnost spojin v superkritičnem ogljikovem dioksidu kljub vsemu obstajajo nekatere splošne zakonitosti: [11] kisikove organske spojine z nizko ali srednjo molsko maso (ketoni, estri, alkoholi...) so zelo dobro topne, večina nepolarnih organskih substanc nizke molske mase (alkani, alkeni, terpeni...) je prav tako dobro topnih, polarne organske snovi (npr. karboksilne kisline) so topne, če nimajo previsoke molske mase, v homolognih vrstah se topnost običajno zmanjšuje z naraščajočo molsko maso, prisotnost polarnih skupin (karboksilne, hidroksilne ali nitro skupine) običajno zmanjšuje topnost spojin, maščobne kisline in njihovi gliceridi imajo nizko topnost. Ekstrakcije s sub- in superkritičnim CO2 imajo pred ekstrakcijami s tekočimi organskimi topili mnogo prednosti: nizke temperature pri ekstrakcijah in s tem majhno termično obremenitev učinkovin, precejšnjo čistost ekstraktov, selektivno sposobnost raztapljanja pri različnih temperaturah in tlakih, izolacijo naravnih spojin v celoti brez izgub posameznih sestavin, popolno fiziološko neoporečnost ter enostavno in energetsko ugodno regeneracijo. Ob tem je ogljikov dioksid okolju prijazno sredstvo za ekstrakcijo in ima na trgu praviloma nizko ceno. [11] Po drugi strani pa imajo superkritične ekstrakcije tudi nekaj slabosti in sicer visoke delovne tlake, visoke investicije v opremo in posledično pri obratovanju ob sedanjem stanju in veliko porabo energije za komprimiranje plinov na delovni tlak. Procesi pri visokih tlakih so v veliki meri kompleksni in ponekod še dokaj neraziskani, zato je bilo na tem področju v zadnjem času narejenih mnogo raziskav. [11] Superkritične ekstrakcije imajo široko področje uporabe [12][13], saj so del naslednjih procesov: ekstrakcij naravnih barvil, hmelja, maščob in olj, eteričnih olj za parfume [14][15], arom, zdravilnih učinkovin iz drog, alkaloidov, antibiotikov iz fermentacijskih brozg, dekofeinacije kave oz. deteinizacije čaja, izolacije naravnih vitaminov, rafinacije naravnih olj, pridobivanja voskov iz propolisa, odstranjevanja živalskih maščob iz mleka ali rumenjakov in separacije izomerov. Pričakovati je, da se bo ob dodatnih raziskavah v prihodnosti področje uporabe še razširilo. 9

22 2. 4 Drobljenje in mletje Drobljenje grobega materiala v drobnejša zrna in mletje teh zrn v še finejši prah sta mehanski operaciji, ki se v kemijski in procesni industriji pogosto uporabljata. Te operacije srečujemo tako pri pripravah surovin kot pri predelavi proizvodov v dokončno komercialno obliko. Zanje se porabi okoli 5% vse po svetu proizvedene električne energije oz. okoli 400 milijard kwh. Mehanski izkoristek industrijskih drobilnih naprav je v splošnem izredno majhen, praviloma pod 1% od vložene energije. [16] Fizikalni principi slonijo na izkoriščanju naravne drobljivosti (lomljivosti) snovi pod vplivom različnih mehanskih sil. Te nastopajo pri stiskanju, zvijanju, tolčenju, gnetenju, striženju, udarjanju, padanju in podobnem obdelovanju materiala z mehanskimi sredstvi. Namen drobljenja in mletja je: [16] povečanje reaktivne površine surovin, ki vstopijo v kemijske postopke, oblikovanje proizvodov ali polproizvodov v mehanično ustrezne oblike, homogeniziranje mešanic trdnih snovi. Obstaja velika razlika v porabljeni energiji glede na z drobljenjem proizvedeno novo površino snovi oz. finočo materiala, kar prikazuje tabela 2-4: Tabela 2-4: Poraba energije v odvisnosti od finoče drobljenja [16] Velikost delcev (mm) Poraba energije (kwh/t) Primarno drobljenje Sekundarno drobljenje Mletje 5-0, Pulverizacija 0,1 0, Zato velja pravilo, da drobimo vse snovi samo do tiste velikosti, ki jo za uporabo v nadaljnjih postopkih res potrebujemo, saj poraba energije glede na finočo nesorazmerno in predvsem pri manjši velikosti delcev zelo strmo narašča. Naprave za drobljenje so drobilniki (čeljustni, krožni, kladivni in grobi za primarno ter udarni, valjčni in kolesni za sekundarno drobljenje), medtem ko so naprave za mletje mlini (kroglični, kotalni, dezintegracijski in koloidni). Vse vrste drobilnikov in mlinov so natančneje opisane v literaturi [16]. 10

23 2. 5 Sejanje Pri drobljenju oz. mletju dobimo vselej zmes zrn različnih velikosti na podlagi njihovega premera. To mešanico lahko razvrščamo glede na velikosti posameznih skupin zrn, v katerih se nahajajo samo zrna od določene najmanjše do prav tako določene največje velikosti. S sejanjem lahko ob pomoči sit, sejalnih površin z normiranimi velikostmi zank, te skupine zrn ločimo. Zmes različno velikih zrn, ki jih želimo ločiti, lahko potuje po sitih na dva različna načina: 1. Sito se giblje (niha, kroži ali vibrira) ter s tem podeljuje zrnom potrebne gibalne impulze. 2. Sito miruje, zrna pa se po njem kotalijo zaradi svoje teže, če je sejalna površina nagnjena. Skozi odprtine (zanke) na situ padejo vsa zrna, ki imajo manjši premer od velikosti njegove odprtine (podzrna), vsa večja zrna (nadzrna) pa ostanejo na njem. V praksi sicer ni povsem tako, saj zrna skoraj nikdar niso idealno okrogla, tako da dobimo v zmesi nadzrn (odsevku) tudi nekaj podzrn, ki bi sicer morala biti v presevku, in obratno. [16] Po sejanju izvedemo sejalno analizo, med katero stehtamo mase posameznih skupin zrn, ki so se zadržala na sitih različnih velikosti. Rezultate podamo tabelarno in v obliki različnih diagramov (krivulj), ki kažejo sestavo sistema glede na velikost zrn (integralna sejalna krivulja) ali pogostnost velikosti posameznih zrn v presejanem materialu (diferencialna sejalna krivulja). Omenjeni krivulji prikazujeta sliki 2-7 in 2-8. Slika 2-7: Integralna sejalna krivulja [16] Slika 2-8: Diferencialna sejalna krivulja [16] 11

24 2. 6 UV-VIS spektrofotometrija Molekule absorbirajo energijo elektromagnetnega valovanja (svetlobe) na različne načine. Največ energije se absorbira pri prehodu elektronov na višje energetske nivoje, manjši del pa se porabi za vibracije, rotacije in translacije atomov v molekuli. Slika 2-9 prikazuje spekter elektromagnetnega valovanja na podlagi njegove frekvence in valovne dolžine: Slika 2-9: Spekter elektromagnetnega valovanja [17] Ultravijolično (UV) območje je pri valovnih dolžinah med 200 in 400 nm, vidno območje (VIS) med 400 in 800 nm ter infrardeče (IR) območje med 2 in 15 µm. [18] Vsa ta območja sicer predstavljajo zelo ozek del spektra elektromagnetnega valovanja, vendar v teh območjih absorbira svetlobo večina organskih snovi, biološko aktivnih in koordinacijskih spojin. Spektrofotometrija je instrumentalna metoda na področju analizne kemije, ki temelji na merjenju absorpcije svetlobe pri prehodu skozi raztopino vzorca. [19] Z IR spektrofotometrijo določimo funkcionalne skupine in strukture organskih molekul, medtem ko UV in VIS spektrofotometrijo uporabljamo za kvantitativno določanje analitov. Absorbanca (A) predstavlja količino absorbirane svetlobe pri prehodu skozi raztopino vzorca, pri čemer se matematično izračuna kot naravni logaritem kvocienta med intenziteto vpadne in intenziteto prepuščene svetlobe, njeno odvisnost od množinske koncentracije merjene čiste snovi pa predstavlja Beer-Lambertov zakon, po katerem se absorbanca izračuna kot produkt konstante molarnega absorpcijskega koeficienta, dolžine kivete oz. prehoda svetlobe skozi snov in množinske koncentracije snovi. [20] Neposredno iz tega zakona vidimo, da je ob višji množinski koncentraciji snovi in enaki optični poti tudi absorbanca višja, vendar zakon velja le v primeru, kadar svetlobni vir oddaja monokromatsko svetlobo oz. svetlobo ene valovne dolžine, pri kateri imajo vsi fotoni v svetlobnem žarku enako energijo, in je koncentracija raztopin pod 10-3 mol/l, saj so takrat spremembe lomnega količnika raztopin minimalne. Kadar pri izbrani valovni dolžini v raztopini absorbira več različnih molekulskih zvrsti, velja aditivnost absorbanc. Poenostavljeno shemo UV-VIS spektrofotometra prikazuje slika

25 Slika 2-10: Poenostavljena shema UV-VIS spektrofotometra [21] Najpomembnejše lastnosti UV-VIS spektrofotometrije so njena široka uporaba, velika občutljivost, selektivnost, točnost in enostavnost uporabe. 13

26 2. 7 Ekstrakcija paprike Na področju ekstrakcij rdeče čili paprike in ostalih vrst paprik je bilo izvedenih že mnogo raziskav. [2], [22]-[27] Najpomembnejši ekstrakcijski produkti z organskimi topili in superkritičnim CO2 so predvsem kapsaicinoidi in barvila, med katerimi prednjačijo karotenoidi. Med kapsaicinoide in sorodne spojine, ki so del ekstraktov pri ekstrakcijah rdeče čili paprike, spadajo naslednje spojine [24] (slika 2-11): Slika 2-11: Kapsaicinoidi in sorodne spojine v rdeči čili papriki [24] Med karotenoidi, ki prevladujejo v ekstraktih rdeče čili paprike, so lutein, β-karoten, kapsantin in zeaksantin. [27] Njihove strukture predstavljajo slike [28] Slika 2-12: Kemijska struktura luteina [29] 14

27 Slika 2-13: Kemijska struktura β-karotena [30] Slika 2-14: Kemijska struktura kapsantina [31] Slika 2-15: Kemijska struktura zeaksantina [32] Medtem ko so kapsaicinoidi uporabni predvsem v medicini, so karotenoidi uporabni v prehrambeni industriji kot aditivi (naravna barvila), pogosto pa so ekstrahirana naravna barvila iz paprike uporabljena tudi za izdelavo šmink v kozmetiki. [11] 15

28 3. Eksperimentalni del (metode dela, aparature) 3. 1 Materiali Za eksperimentalni del smo uporabili rdečo čili papriko iz Makedonije. 99,5% čist ogljikov dioksid in približno enako čista propan in petroleter nam je dobavilo slovensko podjetje Messer iz Ruš. Za povečanje reaktivne površine snovi ter posledično lažje in hitrejše izvajanje ekstrakcij smo morali suh material na samem začetku zmleti na manjša zrna v kavnem mlinčku. Posebej smo zmleli rdeče rastlinsko tkivo ploda rdeče čili paprike in semena v njem, nato pa zmlet material (ločeno rastlinsko tkivo in semena) spravili v zaprte stekleničke v shrambo, suh in temen prostor Ekstrakcija s superkritičnim CO2 Za superkritično ekstrakcijo smo kot superkritični fluid uporabili ogljikov dioksid, ki ima kritično točko pri kritični temperaturi 31 C in kritičnem tlaku 73,8 bar. Delovni pogoji so bili pri temperaturah 40 C in 60 C ter tlakih 100 bar, 200 bar in 300 bar. Posebej smo izvajali ekstrakcije s semeni in rastlinskim tkivom. Shema aparature za superkritično ekstrakcijo s CO2 je prikazana na sliki 3-1: Slika 3-1: Shema laboratorijske aparature za superkritično ekstrakcijo s CO2 [22] V začetnem stanju so bili vsi ventili zaprti, kar pomeni, da je bil skozi njih onemogočen pretok ogljikovega dioksida in vseh preostalih snovi po ceveh. Na tehtnici smo stehtali maso epruvete, ki smo se jo odločili uporabiti pri ekstrakciji. V avtoklav, ki smo ga pred tem sneli z aparata, smo pred vsako ekstrakcijo stresli okoli 15 g prej stehtanega vzorca rdeče čili paprike in vanj na vsaki strani dodali bombažno vato. Nato smo ga s pomočjo ključev za matice različnih velikosti dodatno zatesnili in ga nad gladino vodne kopeli ponovno priključili na aparat. Pri delu z desnosučnimi maticami, ki delujejo na podoben način kot desnosučni vijaki, smo upoštevali angleško pravilo»righty-tighty, lefty-loosey«[33], kar pomeni, da 16

29 gledano s strani, s katere je bil pritrjen desnosučni vijak ali matica, sukanje ključa za matice ali izvijača v desno smer oz. smer urinega kazalca pomeni njegovo privijanje, sukanje v levo smer pa odvijanje. Ker je velika večina vseh vijakov in matic v tehniki desnosučnih, levosučni pa so le v redkih primerih, ima to pravilo veliko uporabno vrednost.[34] Pred začetkom procesa ekstrakcije smo morali najprej avtoklav v celoti potopiti v vodno kopel, odpreti ventil V1, da se je lahko plinasti ogljikov dioksid po ceveh iz sistema jeklenk pretočil v bližino ventila V2, in vključiti temperaturni regulator oz. termostat, ki je vodno kopel segrel na željeno konstantno temperaturo. Ko se je vodna kopel segrela na konstantno temperaturo, smo odprli ventil V2 in vključili na elektriko priključeno visokotlačno črpalko, na kateri smo na zaslonu s pomočjo tipk ob njem vtipkali vrednost željenega tlaka. S pomočjo ukaza»refill«smo njeno notranjost prostornine 103,11 ml v celoti zapolnili z ogljikovim dioksidom. Nato smo potrdili vtipkano vrednost željenega tlaka in plin v črpalki se je s pomočjo kompresorja stisnil do te mere, da se je tlak v notranjosti povišal na željeno vrednost in je CO2 prešel v superkritično stanje. S tem je bilo vse pripravljeno za proces ekstrakcije pri željenih pogojih, zato smo z ukazom»run«in odprtjem ventila V3 spustili superkritični CO2 iz črpalke naprej po cevi do avtoklava ter kasneje delno odprli še ventila V4 in V5, s katerima smo lahko uravnavali pretok superkritičnega CO2 skozi vzorec v avtoklavu. Ob tem smo lahko preostanek volumna CO2 v črpalki odčitali na zaslonu visokotlačne črpalke, tlak v avtoklavu na manometru nad njim, porabljeni volumen CO2 pri ekstrakciji pa na rotametru oz. plinski uri. Tekoči ekstrakt je preko cevi pritekel v nastavljeno epruveto, v kateri se je CO2 pri prehodu nazaj na sobne pogoje uplinil in se pretočil do plinske ure, ki je merila njegov volumen. Po 30 minutah (proti koncu ekstrakcije po 60 minutah) smo proces ekstrakcije zaustavili, pri čemer smo zaprli ventila V3 in V4, na zaslonu visokotlačne črpalke pa pritisnili tipko z ukazom»stop«. Vzeli smo epruveto in na tehtnici stehtali njeno novo maso, ki je bila sedaj nekoliko večja kot na začetku. Po tehtanju smo epruveto vrnili nazaj na njeno mesto in ponovili ves opisan cikel od zapolnjenja celotne prostornine visokotlačne črpalke s CO2 in (ponovnega) začetka ekstrakcije naprej. Ko je bila sprememba v masah epruvete in posledično ekstrakta tako majhna, da smo lahko z gotovostjo trdili, da se bo od takrat naprej v vseh naslednjih ciklih spremenila le še v zelo majhni meri, smo s procesom ekstrakcije zaključili. Takrat smo zaprli ventile V1, V2 in V3 ter zaustavili delovanje visokotlačne črpalke. Ves preostali CO2 v ceveh od ventila V3 naprej in v avtoklavu smo sprostili v okolico tako, da smo do konca odprli ventila V4 in V5. Ko se je tlak v avtoklavu vrnil na vrednost tistega v okolici oz. v njem ni bilo nikakršnega nadtlaka več, je to pomenilo, da v njem ni več CO2; takrat smo ga lahko ponovno dvignili nad gladino vodne kopeli in ga sneli z aparata, prav tako smo lahko ponovno zaprli ventila V4 in V5. Ko smo iz avtoklava spravili ves material in bombažno vato, smo ga počistili s pomočjo naprave za pihanje s stisnjenim zrakom. Ponovno čist je bil pripravljen za naslednjo ekstrakcijo pri drugačnih pogojih. S pomočjo dobljenih/odčitanih rezultatov smo lahko izračunali izkoristek (dobit) ekstrakcije in poseben S/F faktor za superkritično ekstrakcijo. Izkoristek ekstrakcije predstavlja kvocient 17

30 med maso ekstrakta in maso celotnega vzorca, S/F faktor pa kvocient med maso porabljenega CO2 za ekstrakcijo in maso celotnega vzorca. Pri izračunu mase porabljenega CO2 smo privzeli idealnost plina in maso izračunali s pomočjo izpeljave splošne plinske enačbe (enačba 3.1): m CO 2 = p z V CO 2 M CO 2 R T z (3.1) kjer so m (CO2), V (CO2) in M (CO2) masa, volumen in molska masa CO2, pz in Tz tlak in temperatura okolice ter R splošna plinska konstanta z vrednostjo 8,314 J K -1 mol Ekstrakcija s subkritičnim propanom Propan ima kritično točko pri kritični temperaturi 97 C in kritičnem tlaku 42,4 bar. Delovni pogoji za ekstrakcijo so bili pri temperaturah 40 C in 60 C ter tlakih 100 bar in 200 bar, kar pomeni, da je tlak pri teh pogojih sicer presegal kritičnega, medtem ko je bila temperatura nižja od kritične. Propan, je bil torej pri teh pogojih v subkritičnem stanju kot utekočinjen plin. Aparatura je bila podobna oz. skoraj enaka aparaturi, ki smo jo uporabljali pri superkritični ekstrakciji s CO2, le da smo namesto ogljikovega dioksida kot topilo uporabili propan in je bila na poti do materiala vključena poleg visokotlačne plinske črpalke zaradi vmesne spremembe agregatnega stanja tudi visokotlačna tekočinska črpalka. Ekstrakcijo s subkritičnim propanom smo izvajali po popolnoma istem postopku kot superkritično ekstrakcijo s CO2, vendar je bil v tem primeru propan pri delovnih pogojih v tekočem agregatnem stanju in se je ponovno uplinil v epruveti, v katero smo ujeli ekstrakt. Paziti smo morali na to, da v bližini ni bilo izvirov ognja, saj je propan zelo lahko vnetljiv plin. 18

31 3. 4 Ekstrakcija s petroletrom v Soxhletovem aparatu Ekstrakcijski aparat po Soxhletu, ki je poimenovan po svojem izumitelju, nemškem kemiku Franzu von Soxhletu, je laboratorijski aparat za ekstrakcijo sestavin trdnih snovi s pomočjo hlapljivega organskega topila, v njem poteka torej ekstrakcije trdno-tekoče. Aparat sestavljajo destilirka, povratni hladilnik in cilindrični del, deluje na principu povratnega hlajenja topila. Prvotno je bil namenjen ekstrakciji lipidov iz trdnih materialov. [35] Prikazuje ga slika 3-2: Slika 3-2: Skica Soxhletovega aparata [35] Stehtan zmlet material smo prenesli v tulec iz filtrirnega papirja in ga previdno vstavili v aparaturo. V bučko smo nalili petroleter (zmes ogljikovodikov s 5 in 6 ogljikovimi atomi, komercialno znana kot bencin za čiščenje [36]) in dodali nekaj vrelnih kamenčkov. Preden smo začeli s segrevanjem topila, smo preverili tesnenje aparature in dotok hladilne vode. Na začetko smo segrevali previdno in počasi ojačevali moč plamena. Po približno 15 minutah se je aparatura segrela na delovno temperaturo. Pri tej temperaturi je topilo začelo krožiti, torej je vrelo v bučki in se na vrhu naprave v bližini hladilnika kondenziralo nazaj v tekoče agregatno stanje ter se vrnilo nazaj v bučko. Ta cikel smo ponavljali tako dolgo, dokler so bile med cikloma še opazne bistvene spremembe v obarvanosti. Ko je v ekstrakcijskem aparatu potekel še zadnji cikel, smo prenehali s segrevanjem in počakali, da se je aparat ohladil. Topilo z ekstraktom smo prelili v erlenmajerico z obrusom, nato pa topilo oddestilirali iz ekstrakcijske zmesi na rotavaporju pri znižanem tlaku. V erlenmajerici je tako ostal le še ekstrakt, ki smo ga stehtali na tehtnici. Izkoristek ekstrakcije smo izračunali kot kvocient med maso ekstrakta in maso začetnega materiala pred ekstrakcijo. [35] 19

32 3. 5 Sejalna analiza Zdrobljeni trdni delci so v splošnem množica delcev, ki se med seboj razlikujejo po masi, obliki in velikosti. S sejanjem smo dosegli ločitev delcev po velikosti zrn na presejalna zrna D (presevek) in ostanek zrn na situ (R). Slika 3-3 prikazuje shemo aparature, s pomočjo katere smo izvedli sejanje: Slika 3-3: Shema sejalnega vibracijskega stroja [35] Sejalna aparatura je bila sestavljena iz vibratorja in stavka 7 različnih sit z velikostmi zank 1 mm, 0,80 mm, 0,63 mm, 0,50 mm, 0,40 mm, 0,315 mm in 0,250 mm. Zadnje sito ni imelo zank in je bilo namenjeno za zbiranje preostalega presevka oz. zrn, katerih premer je bil manjši od 0,250 mm. Stavek sit je bil sestavljen tako, da je velikost zank padala od zgoraj navzdol. Zatehtali smo 100 g zrn in jih stresli na zgornje sito. Stavek sit smo pokrili s pokrovom, vključili vibrator stroja in na sejalnem stroju sejali 10 minut. Po koncu sejanja smo zbrali posamezna sita in na tehtnici stehtali maso vsake frakcije posebej, pri tem smo si za izpraznjenje vsakega sita pomagali s finimi čopiči. Posebej smo izvedli sejalno analizo zrn semen in rastlinskega tkiva. Rezultate smo si zapisali v tabelo in izračunali srednjo velikost zrn posameznih frakcij, interval velikosti zrn v posamezni frakciji in delež mase posamezne frakcije glede na celotno maso preiskovanega materiala. S pomočjo izračunanih podatkov smo narisali integralno in diferencialno sejalno krivuljo, izračunali koeficient zrnatosti k in na diferencialni krivulji odčitali velikost najpogosteje zastopanega zrna. 20

33 3. 6 UV-VIS spektrofotometrija Za metodo, po kateri smo določili obarvanost ekstraktov po CU (Colour Unit) vrednostih, smo zatehtali 20 mg ekstrakta v bučko in z acetonom (CH3COCH3) razredčili do volumna 2 ml. Od tega smo s pipeto odpipetirali 0,1 ml in vzorec z acetonom dodatno razredčili do volumna 10 ml. Tako pripravljene vzorce smo na UV-VIS spektrofotometru (njegova shema je predstavljena na sliki 2-10 v sklopu teoretičnega dela) postavili k senzorju, s pomočjo katerega smo izmerili absorbance pri valovni dolžini 462 nm. Rezultate smo odčitali na računalniku. Kot standard za merjenje absorbanc smo uporabili čisti aceton. Obarvanost ekstrakta smo izračunali po enačbi 3.2 iz literature [22]: kjer je: CU = A m ekst (3.2) CU A mekstr barvna intenziteta oz. obarvanost ekstrakta (Colour Unit) absorbanca, izmerjena z UV-VIS spektrofotometrom masa ekstrakta (g) Barvno moč rdeče čili paprike oz. vsebnost pigmentov v vhodnem materialu smo določili po metodi ASTA 20, ki jo je leta 1968 patentirala organizacija ASTA (American Spice Trade Association, Ameriško združenje za trgovino z začimbami). [22] Po tej metodi smo zatehtali okoli 0,1 g surovega vhodnega materiala in ga dali v bučko, v katero smo dolili aceton do oznake 100 ml; dobljeno raztopino smo dobro premešali. Potem ko smo raztopino za približno 16 ur shranili v temen prostor pri sobni temperaturi, smo na UV-VIS spektrofotometru pri valovni dolžini 460 nm izmerili absorbanco. Merjenje smo izvedli posebej za semena in rastlinsko tkivo. Kot standard za merjenje absorbanc smo uporabili čisti aceton. Barvno moč rdeče čili paprike smo podali v ASTA enotah, ki smo jih izračunali po enačbi 3.3 iz literature [37] (ob predpostavljeni vrednosti deviacije spektrofometra If=1): ASTA = A 16,4 m ekst (3.3) kjer je: ASTA A mekstr barvna moč rdeče čili paprike v vhodnem materialu absorbanca, izmerjena z UV-VIS spektrofotometrom masa ekstrakta (g) 21

34 4 Rezultati in diskusija 4. 1 Semena izkoristek (%) C, 300 bar 40 C, 200 bar 40 C, 100 bar S/F (kg/kg) Slika 4-1: Ekstrakcijske krivulje semen rdeče paprike za superkritično ekstrakcijo s CO2 pri 40 C izkoristek (%) C, 300 bar 60 C, 200 bar 60 C, 100 bar S/F (kg/kg) Slika 4-2: Ekstrakcijske krivulje semen rdeče paprike za superkritično ekstrakcijo s CO2 pri 60 C 22

35 izkoristek (%) Izolacija rdečih pigmentov iz paprike s plini visoke gostote Sliki 4-1 in 4-2 kažeta, da se pri supekritični ekstrakciji s CO2 učinkovitost (izkoristek) ekstrakcije pri konstantni temperaturi znatno povečuje z zviševanjem vrednosti tlaka. Tlak 100 bar je očitno prenizek za izvajanje te vrste ekstrakcije, saj ima pri semenih ekstrakcija pri tem tlaku izjemno majhen izkoristek. Ekstrakcija semen pri 300 bar je najučinkovitejša in srednje hitra, medtem ko je ekstrakcija pri 200 bar izjemno dolga (najdaljša je trajala 1200 minut oz. 20 ur), končni izkoristek pa je približno dvakrat manjši kot pri ekstrakciji pri 300 bar. Sprememba temperature pri konstantnem tlaku po drugi strani nima velikega vpliva na izkoristek superkritične ekstrakcije s CO2, malenkost višji izkoristek smo sicer zabeležili pri ekstrakcijah z nižjo temperaturo, torej pri 40 C. Iz tega sklepamo, da pri superkritičnem CO2 pri teh pogojih še prevladuje vpliv gostote topila proti naraščanju parnega tlaka topljenca in se izkoristek še zmanjšuje z zviševanjem temperature. Tabela 4-1: Vrednosti gostot ogljikovega dioksida pri različnih temperaturah in tlakih [22] T ( C) p (bar) ρ (kg/m 3 ) gostota (kg/m 3 ) Slika 4-3: Izkoristek ekstrakcije semen rdeče paprike v odvisnosti od gostote ogljikovega dioksida Slika 4-3 kaže, da izkoristek superkritične ekstrakcije s CO2 narašča z zviševanjem gostote topila. Največji porast izkoristka ekstrakcije opazimo med gostotama 600 in 800 kg/m 3. Podatke za gostote CO2 pri različnih pogojih smo našli v literaturi [22] in so zabeleženi v tabeli

36 izkoristek (%) C, 100 bar 40 C, 200 bar 40 C, 100 bar S/F (kg/kg) Slika 4-4: Ekstrakcijske krivulje semen rdeče paprike za ekstrakcijo s subkritičnim propanom Na sliki 4-4 lahko vidimo, da ekstrakcije s subkritičnim propanom potečejo precej hitreje od superkritičnih ekstrakcij s CO2, prav tako ekstrakcija poteče že tudi pri tlaku 100 bar. Izkoristki pri tlakih 100 in 200 bar so v skoraj vseh primerih podobni ali v nekaterih primerih celo večji kot pri superkritični ekstrakciji s CO2 pri tlaku 300 bar. Ker gre v osnovi še vedno za ekstrakcijo trdno-tekoče, čeprav je presežen kritični tlak, je topnost trdnega topljenca v tekočem topilu višja pri višji temperaturi, zato je pri ekstrakciji s subkritičnim propanom izkoristek pri 60 C boljši kot pri 40 C. Edina slabost te ekstrakcije je zelo lahka vnetljivost propana, zaradi česar moramo biti pri delu bolj previdni kot pri superkritični ekstrakciji s CO2, vendar pri ločevanju propana od ekstrakta prav tako ni nobenih težav, saj se propan ob prehodu na sobni tlak in temperaturo ponovno uplini vsota R (%) ,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 d z (mm) Slika 4-5: Integralna sejalna krivulja za semena 24

37 Mediansko zrno (pri R=50%) : d (R50)= 0,570 mm Koeficient zrnatosti: k = d R 25 d R 75 0,802 mm = = 2, 371 0,338 mm Neenakomerna zrnatost (k > 1,5) ΔR/Δd z (%/mm) ,2 0,4 0,6 0,8 1 d povprečni (mm) Slika 4-6: Diferencialna sejalna krivulja za semena Najpogosteje zastopano zrno: d = 0,45 mm Rezultati sejalne analize semen (sliki 4-5 in 4-6) kažejo, da zrnatost materiala po mletju v kavnem mlinčku sicer kljub vsemu ni enakomerna (koeficient zrnatosti je večji od 1,5 in posledično pomeni neenakomerno zrnatost), vendar je še vedno največje število delcev po velikosti možno najti na področju v bližini medianskega zrna. 25

38 CU T ( C) p (bar) Slika 4-7: Vrednosti obarvanosti pri ekstraktih semen po ekstrakciji s superkritičnim CO CU T ( C) p (bar) Slika 4-8: Vrednosti obarvanosti pri ekstraktih semen po ekstrakciji s subkritičnim propanom Na slikah 4-7 in 4-8 lahko vidimo, da višja temperatura zmanjšuje obarvanost ekstrakta, iz česar sklepamo, da so mnoga barvila v rdeči papriki temperaturno občutljiva in se razgradijo že pri temperaturi 60 C. Zviševanje tlaka je pri semenih po drugi strani pustilo različne posledice pri obeh različnih tipih ekstrakcije z višjimi tlaki, saj se je obarvanost ekstrakta ob zviševanju tlaka pri superkritični ekstrakciji s CO2 zmanjšala, pri ekstrakciji s subkritičnim propanom pa povečala. Predvidevamo, da te razlike nastanejo zaradi različnih kemijskih lastnosti CO2 in propana, pri čemer so nepolarna barvila z dolgimi nepolarnimi verigami v subkritičnem propanu bolje topna kot v superkritičnem ogljikovem dioksidu, zato večji izkoristek ekstrakcije pri višjem tlaku v tem primeru preseže morebitno razgradljivost barvil pri višjem tlaku. Kljub vsemu je celotna obarvanost ekstrakta pri vseh pogojih višja pri superkritični ekstrakciji s CO2, predvsem pri nižjem tlaku. 26

39 4. 2 Rastlinsko tkivo 2,5 2,0 izkoristek (%) 1,5 1,0 0,5 60 C, 200 bar 40 C, 200 bar 0, S/F (kg/kg) Slika 4-9: Ekstrakcijski krivulji rastlinskega tkiva rdeče paprike za superkritično ekstrakcijo s CO2 Slika 4-9 prikazuje, da se pri superkritični ekstrakciji rastlinskega tkiva za razliko od superkritičnih ekstrakcij semen pri izkoristku ekstrakcije bolj pozna sprememba temperature, saj je ob istem tlaku 200 bar pri temperaturi 60 C izkoristek pri 40 C kar dvakrat višji. Sklepamo, da ima pri rastlinskem tkivu sprememba temperature dokaj velik vpliv na sam material, ki ni tako trd kot semena, s tem pa se olajša pot ogljikovemu dioksidu ob prodiranju vanj. Ekstrakciji rastlinskega tkiva pri 60 C in 100 bar ter 40 C in 100 bar nista potekli, saj je za ekstrakcijo rastlinskega tkiva s CO2 tlak 100 bar očitno prenizek. V 4 ciklih oz. 2 urah ni nastalo nič ekstrakta, zato smo lahko upravičeno sklepali, da ekstrakcija v tem primeru ne poteče. izkoristek (%) 4,5 4,0 3,5 3,0 2,5 2,0 1,5 1,0 0,5 0, S/F (kg/kg) 40 C, 200 bar 60 C, 200 bar 60 C, 100 bar Slika 4-10: Ekstrakcijske krivulje rastlinskega tkiva rdeče paprike za ekstrakcijo s subkritičnim propanom 27

40 Slika 4-10 kaže, da je tudi pri rastlinskem tkivu ekstrakcija s subkritičnim propanom precej hitrejša kot superkritična ekstrakcija z ogljikovim dioksidom, vendar pri rastlinskem tkivu ekstrakcija pri 100 bar skorajda ne poteče niti pri ekstrakciji s subkritičnim propanom vsota R (%) ,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 d z (mm) Slika 4-11: Integralna sejalna krivulja za rastlinsko tkivo Mediansko zrno (pri R=50%) : d (R50)= 0,580 mm Koeficient zrnatosti: k = d R 25 d R 75 0,835 mm = = 2, 562 0,326 mm Neenakomerna zrnatost (k > 1,5) ΔR/Δd z (%/mm) ,2 0,4 0,6 0,8 1 d povprečni (mm) Slika 4-12: Diferencialna sejalna krivulja za rastlinsko tkivo Najpogosteje zastopano zrno: d = 0,45 mm 28

41 Rezultati sejalne analize pri rastlinskem tkivu (sliki od 4-11 in 4-12) kažejo, da zrnatost materiala po mletju v kavnem mlinčku sicer kljub vsemu ni enakomerna (koeficient zrnatosti je večji od 1,5 in posledično pomeni neenakomerno zrnatost), vendar je še vedno največje število delcev po velikosti možno najti na področju v bližini medianskega zrna. Opazimo lahko sicer malce večje odstopanje v velikosti zrn kot pri semenih, posledično tudi večji koeficient zrnatosti, saj smo lahko našli velik del zrn tudi na področju velikosti zrn okoli 0,70 mm, kar je za 0,25 več od velikosti medianskega zrna za ta material CU T ( C) p (bar) Slika 4-13: Vrednosti obarvanosti pri ekstraktih rastlinskega tkiva po ekstrakciji s superkritičnim CO CU T ( C) p (bar) Slika 4-14: Vrednosti obarvanosti pri ekstraktih rastlinskega tkiva po ekstrakciji s subkritičnim propanom Sliki 4-13 in 4-14 potrjujeta ugotovitev glede zmanjševanja obarvanosti s povečevanjem temperature tudi pri rastlinskem tkivu. 29

42 izkoristek (%) Izolacija rdečih pigmentov iz paprike s plini visoke gostote 4. 3 Primerjava med semeni in rastlinskim tkivom Opazna je ogromna razlika pri izkoristku med ekstrakcijami s semeni in rastlinskim tkivom, pri čemer je izkoristek ekstrakcije precej manjši pri ekstrakcijah z rastlinskim tkivom. Predvidevamo, da je v semenih več v superkritičnem CO2 in subkritičnem propanu dobro topnih substanc kot v rastlinskem tkivu (poleg kapsaicina in barvil še npr. maščobe oz. olja), na razliko pa bi lahko v večji meri vplivali še nekateri drugi dejavniki, denimo razlike v poroznosti materiala ali morebitne razlike pri samih značilnostih ekstrakcije. Če namreč hitrost ekstrakcijskega procesa kontrolira difuzija topljenca s površine delca v glavno maso topila, pomletev materiala nima posebnega učinka, medtem ko ima po drugi strani velik učinek, če hitrost procesa kontrolira difuzija topljenca skozi porozni material na površino delca, kjer pride v stik s topilom št. ciklov semena rastl. tkivo Slika 4-15: Število izvedenih ciklov pri ekstrakcijah s Soxhletovim aparatom semena rastl. tkivo Slika 4-16: Izkoristek pri ekstrakcijah s Soxhletovim aparatom 30

43 Ekstrakcija s petroletrom v Soxhletovem aparatu (sliki 4-15 in 4-16) se je izkazala (glede na izkoristek) za približno enako učinkovito kot superkritična ekstrakcija s CO2 pri tlaku 300 bar ali ekstrakcija s subkritičnim propanom pri 200 bar. Prav tako ima petroleter nizko temperaturo vrelišča (literatura jo navaja med 35 in 65 C, pri čemer je temperatura vrelišča odvisna od sestave zmesi [36]), ekstrakcija pa lahko brez problema poteka v bližini normalnega tlaka 1 atm oz. 1,013 bar. Pričakovano je tudi tukaj ekstrakcija rastlinskega tkiva potekala počasneje kot ekstrakcija semen, kar se kaže v večjem številu ciklov pri ekstrakciji rastlinskega tkiva. Slabost te ekstrakcije v primerjavi s superkritično ekstrakcijo s CO2 in ekstrakcijo s subkritičnim propanom je v tem, da moramo petroleter kot topilo ločiti od ekstrakta s pomočjo destilacije v rotavaporju, vendar pri tem ni nujno, da je nastali ločeni ekstrakt popolnoma čist in ne vsebuje tudi manjšega dela petroletra, problemi glede tega znajo nastati predvsem v prehrambeni industriji ASTA semena rastl. tkivo Slika 4-17: Vrednosti barvne moči pri vhodnem materialu, topilo aceton Barvna moč rdeče čili paprike, ki jo obravnava slika 4-17, je mnogo večja pri rastlinskem tkivu kot pri semenih, kar je pričakovano, saj rastlinsko tkivo predstavlja rdeči del ploda rdeče čili paprike, medtem ko so semena v njeni notranjosti že navidezno precej manj bogata z barvili. To dejstvo ima osnove v samih bioloških značilnostih rdeče čili paprike, pri čemer z rdečo barvo ploda privabi ptiče in ostale živali, ki potem raztrosijo manj obarvana semena na tla in s tem pripomorejo k nadaljnjemu razmnoževanju rastline. Na podlagi vseh rezultatov lahko sklepamo, da je za ekstrakcijo barvil v industriji zagotovo najprimernejša metoda superkritična ekstrakcija s CO2, saj je v ekstraktu glede na izmerjeno barvno intenziteto oz. obarvanost dokaj visok delež barvil, prav tako je produkt čist in CO2 je kot topilo in plin v splošnem na površju Zemlje nenevaren za okolje in se zaradi višje molske mase od povprečne molske mase zraka, zaradi česar je težji od zraka, sam od sebe ne dvigne v višje plasti atmosfere, kjer sicer povzroča pojav tople grede. Za ekstrakcijo kapsaicina vidimo kot najprimernejšo metodo ekstrakcijo s subkritičnim propanom, saj je kapsaicin tako kot propan nepolaren oz. hidrofoben ter tako dobro topen v subkritičnem propanu, ob tem pa ekstrakcija s subkritičnim propanom poteče precej hitreje kot superkritična ekstrakcija s CO2. Pri tem zelo lahka vnetljivost propana ne bi smela biti problem za industrijo. V manj razvitih državah, ki si v industriji ne morejo privoščiti dražjih aparatur za visokotlačne ekstrakcije, je v obeh primerih uporabna metoda ekstrakcije trdno-tekoče v Soxhletovem aparatu in podobnih ekstrakcijskih napravah, pri tem se mora vzeti v zakup morebitno manjšo nečistost produkta. 31

44 5 Zaključek Namen diplomskega dela je bil dosežen, saj smo lahko izvedli vse predvidene metode in jih med seboj primerjali. Glavno spoznanje ob zaključku je, da so visokotlačne ekstrakcije kot ekstrakcije zelo primerne in perspektivne za uporabo v industriji na področjih, ki so bila v preteklosti rezervirana za konvencionalne ekstrakcije trdno-tekoče, predvsem zaradi čistosti nastalih ekstraktov. Kljub temu so ekstrakcije trdno-tekoče še zmeraj uporabne predvsem v manj razvitih državah, dokler so cene aparatur za visokotlačne ekstrakcije na trgu in pri obratovanju za te države previsoke in si jih v industriji ne morejo privoščiti. Zaradi tega dejstva bo še potreben dodaten razvoj na področju visokotlačnih ekstrakcij, predvsem na področju industrijskih naprav za te procese. Prav tako so področja visokih tlakov zaenkrat še precej neraziskana, predvsem pri tlakih, ki jih današnje naprave še ne zmorejo doseči, zato lahko pričakujemo, da bo na tem področju odkritega še marsikaj, kar nam zaenkrat še ni znanega. Zagotovo je področje preučevanja sprememb pri visokih tlakih zelo perspektivno področje kemije in znanosti nasploh, kar med drugim dokazujejo že tudi znanstvena preučevanja Marianskega jarka, z metri najgloblje točke površja Zemljine skorje, kjer tlak na dnu znaša 1086 bar oz. 108,6 MPa. [38] V diplomskem delu smo izvedli in preučili ekstrakcijske procese z rdečo čili papriko in prišli do spoznanja, da je za ekstrakcijo barvil iz paprike najprimernejša metoda superkritične ekstrakcije s CO2, za ekstrakcijo kapsaicina pa ekstrakcija s subkritičnim propanom. Največji izkoristek ekstrakcije smo zabeležili pri ekstrakciji trdno-tekoče v Soxhletovem aparatu. Pomembno je tudi to, da smo se spoznali z izvedbo najrazličnejših vrst ekstrakcij v teoriji in praksi, kar nam bo pri nadaljnjem študiju in kasneje na delovnem mestu zagotovo precej koristilo, kakor tudi to, da smo se srečali z napravo, ki jo je bilo potrebno dokončno sestaviti in jo ponovno razstaviti s pomočjo različnih delovnih orodij, ki se pogosto uporabljajo v strojništvu in posledično industriji (npr. ključi za matice). Področje dela pa je obsegalo tudi analitično metodo UV-VIS spektrofotometrije, ki je zelo pomembna metoda v moderni analizni kemiji na področju industrijske instrumentalne analize. Prispevek k znanosti tega diplomskega dela je sicer majhen, saj je raziskovalno področje dokaj ozko in se eksperimentalni del nanaša več ali manj na področje rdeče čili paprike, vendar je en del v sklopu raziskav visokotlačnih procesov, ki so kot celota za znanost zelo pomembni in bodo očitno v prihodnosti vse bolj pomembni tako za znanost kot življenje nasploh. Prav tako diplomsko delo dokazuje, da stare konvencionalne metode niso vedno nujno zastarele in so v marsikaterih primerih še zmeraj uporabne. Zato to diplomsko delo v splošnem poleg ozkega področja dela odpira še marsikatera druga področja in vprašanja znanosti kot celote ter služi kot nekakšen most med starim in novim, s tem da prikazuje uporabnost obojega. 32

45 6 Literatura [1] Wikipedia - The Free Encyclopedia. Chili Pepper. (dostop: ) [2] Bae H., Jayaprakasha G. K., Jifon J., Patil B. S. Extraction Efficiency and Validation of an HPLC Method for Flavonoid Analysis in Peppers. Food Chemistry, 130, , [3] Kidmose U., Yang R.-Y., Thilsted S. H., Christensen L. P., Brandt K. Content of Carotenoids in Commonly Consumed Asian Vegetables and Stability and Extractability during Frying. Journal of Food Composition and Analysis, 19, , [4] Wikipedija - prosta enciklopedija. Paprika. (dostop: ) [5] Forzasupplements.co.uk. Slika plodov rdeče čili paprike. (dostop: ) [6] Toasto.com. Slika notranjosti ploda rdeče čili paprike s semeni. (dostop: ) [7] The Nibble The Magazine About Specialty Foods. Chile Pepper History & Chile Pepper Glossary. (dostop: ) [8] Agrocrops.com. Red Dry Chillies. (dostop: ) [9] Wikipedia - The Free Encyclopedia. Scoville Scale - Peppers. (dostop: ) [10] Wikipedia - The Free Encyclopedia. Vitamin C - Plant Sources. (dostop: ) [11] Knez Ž., Škerget M. Termodifuzijski separacijski procesi (zbrano gradivo). Maribor: Univerza v Mariboru, Fakulteta za kemijo in kemijsko tehnologijo, [12] Herrero M., Mendiola J. A., Cifuentes A., Ibañez E. Supercritical Fluid Extraction: Recent Advances and Applications. Journal of Chromatography A, [13] Angela M., Meireles A. Supercritical Extraction from Solid: Process Design Data ( ). Current Opinion in Solid State and Materials Science, 7, , [14] Reverchon E. Supercritical Fluid Extraction and Fractionation of Essential Oils and Related Products. Journal of Supercritical Fluids, 10, 1-37, [15] Reverchon E., Senatore F. Isolation of Rosemary Oil: Comparision between Hydrodistillation and Supercritical CO2 Extraction. Flavour and Fragrance Journal, 7, , [16] Ozim V., Knez Ž. Mehanska tehnika (zbrano gradivo). Maribor: Univerza v Mariboru, Fakulteta za kemijo in kemijsko tehnologijo [17] Skeptik.si. Slika spektra elektromagnetnega valovanja. (dostop: ) [18] Wikipedia - The Free Encyclopedia. Electromagnetic Spectrum. (dostop: ) [19] Wikipedija - prosta enciklopedija. Spektrofotometrija. (dostop: ) [20] Brodnjak-Vončina D. Analizna kemija II (zbrano gradivo). Maribor: Univerza v Mariboru, Fakulteta za kemijo in kemijsko tehnologijo

46 [21] Chemwiki.ucdavis.edu. Slika poenostavljene sheme UV-VIS spektrofotometra. (dostop: ) [22] Knez Ž., Škerget M., Weinreich B., Perva-Uzunalić A. Extraction of Chilli Pepper (var. Byedige) with Supercritical CO2: Effect of Pressure and Temperature on Capsaicinoid and Colour Extraction Efficiency. Food Chemistry, 87, 51-58, [23] Duarte C., Moldão-Martins M., Gouveia A., Beirão da Costa S., Eduardo Leitão A., Bernardo-Gil G. Supercritical Fluid Extraction of Red Pepper (Capsicum frutescens L.). Journal of Supercritical Fluids, 30, , [24] Contreras-Padilla M., Yahia E. M. Changes in Capsaicinoids during Development, Maturation and Senescence of Chile Peppers and Relation with Peroxidase Activity. J. Agric. Food Chemistry, 46, , [25] Santamaria R. I., Reyes-Duarte M. D., Bárzana E., Fernando D., Gama F. M., Mota M., López-Munguía A. Selective Enzyme-Mediated Extraction of Capsaicinoids and Carotenoids from Chili Guajillo-Puya (Capsicum annuum L.) Using Ethanol as Solvent. J. Agric. Food Chemistry, 48, , [26] Osuna-García J. A., Wall M. W., Waddell C. A. Endogenous Levels of Tocopherols and Ascorbic Acid during Fruit Ripening of New Mexican-Type Chile (Capsicum annuum) Cultivars. J. Agric. Food Chemistry, 46, , [27] Gómez-Garcia M., Ochoa-Alejo N. Biochemistry and Molecular Biology of Carotenoid Biosynthesis in Chili Peppers (Capsicum spp.). International Journal of Molecular Sciences, 14 (9), , [28] Wikipedia - The Free Encyclopedia. Carotenoid. (dostop: ) [29] Wikipedia - The Free Encyclopedia. Lutein. (dostop: ) [30] Wikipedia - The Free Encyclopedia. Beta-Carotene. (dostop: ) [31] Wikipedia - The Free Encyclopedia. Paprika Oleoresin. (dostop: ) [32] Wikipedia -The Free Encyclopedia. Zeaxanthin. (dostop: ) [33] Bikecollectives.org. Righty Tighty, Lefty Loosey. (dostop: ) [34] Wikipedia - The Free Encyclopedia. Screw. (dostop: ) [35] Knez Ž., Habulin M., Ozim V. Navodila za vaje iz analize procesov in mehanske tehnike (zbrano gradivo). Maribor: Univerza v Mariboru, Fakulteta za kemijo in kemijsko tehnologijo, [36] Wikipedia- Die freie Enzyklopädie. Petrolether. (dostop: ) [37] Lee J. H., Sung T. H., Lee K. T., Kim M. R. Effect of Gamma-irradiation on Color, Pungency and Volatiles of Korean Red Pepper Powder. Journal of Food Science, 69 (8), , [38] Wikipedija - prosta enciklopedija. Marianski jarek. (dostop: ) 34

47 7 Življenjepis OSEBNI PODATKI Tadej Ojsteršek Ulica Draga Kobala 16, 2000 Maribor, Slovenija Spol Moški Datum rojstva Državljanstvo Slovensko DELOVNE IZKUŠNJE Študijska praksa na 1. bolonjski stopnji študija Zavod za zdravstveno varstvo Maribor, Prvomajska 1, 2000 Maribor vzorčenje vod na terenu po celotni Sloveniji: reke, jezera, morje, mineralne, izvirske in podzemne vode, konzerviranje vod in opravljanje terenskih meritev na terenu ter dostava vzorcev, ostale dejavnosti: pomoč pri vnašanju rezultatov meritev v Excel, pisanje poročila v Wordu, fotokopiranje, iskanje geografskih koordinat naslovov in ostalih statističnih podatkov SURS in ARSO po spletu, pomoč pri skladiščnih in arhivskih dejavnostih (urejanje, preusmerjanje, raznašanje), čiščenje in pospravljanje prostorov za shranjevanje inventarja. Vrsta dejavnosti ali sektor Inštitut za varstvo okolja, Oddelek za vode, prehrano in predmete splošne rabe IZOBRAŽEVANJE IN USPOSABLJANJE Gimnazijski maturant II. gimnazija Maribor, Trg Miloša Zidanška 1, 2000 Maribor 35