Ekstrakcija biološko aktivnih spojin iz različnih vrst gob družine Polyporaceae (luknjarke)

Transcription

1 Andreja Horvat Ekstrakcija biološko aktivnih spojin iz različnih vrst gob družine Polyporaceae (luknjarke) Diplomsko delo Maribor, 2016

2 Ekstrakcija biološko aktivnih spojin iz različnih vrst gob družine Polyporaceae (luknjarke) Diplomsko delo univerzitetnega študijskega programa I. stopnje Študentka: Študijski program: Predvideni strokovni naslov: Mentor: Somentor: Somentorica: Andreja Horvat univerzitetni študijski program I. stopnje Kemijska tehnologija diplomirana inženirka kemijske tehnologije (UN) prof. dr. Željko Knez dr. Andrej Gregori Darija Cör, uni. dipl. inž. kem. teh. Maribor, 2016

3

4

5 Kazalo Kazalo... I Seznam tabel... III Seznam slik... IV Izjava... V Zahvala... VI Povzetek... VII Abstract... VIII Uporabljeni simboli in kratice... IX 1 Uvod Metode dela in materiali Polyporaceae Dlakava slojevka (Stereum hirsutum) Dišeča tramovka (Gleophyllum odoratum) Bukova kresilka (Fomes fomentarius) Pisana ploskocevka (Trametes versicolor) Sploščena pološčenka (Ganoderma applanatum) Smrekova kresilača (Fomitopsis pinicola) Grbasta ploskocevka (Trametes gibbosa) Kosmata ploskocevka (Trametes hirsuta) Lekarniška macesnovka (Laricifomes officinalis) Brezova odpadljivka (Piptoporus betulinus) Antioksidanti Ekstrakcija trdno tekoče Transesterifikacija Plinska kromatografija Eksperimentalni del Laboratorijski pribor, aparature in kemikalije Priprava materiala Klasična ekstrakcija (CE) s heksanom Biološka analiza ekstraktov Kemijska analiza ekstraktov I

6 4 Rezultati in diskusija Določanje vsebnosti skupnih fenolov Določanje AOA z radikalsko metodo (DPPH ) Določevanje vsebnosti MK Zaključek Literatura Priloge Priloga Priloga Priloga Priloga Priloga Priloga II

7 Seznam tabel Tabela 2-1: Klasifikacija Polyporaceae... 4 Tabela 2-2: Najpogostejše nasičene MK Tabela 2-3: Najpogostejše nenasičene MK prisotne v naravi Tabela 4-1: 10 zdravilnih gob druţine Polyporaceae in rezultati analiz Tabela 7-1: Vrste gob druţine Polyporaceae Tabela 7-2: Izkoristki ekstrakcij Tabela 7-3: Masa vzorcev za analizo in vlaga Tabela 7-4: Inhibicija DPPH Tabela 7-5: Vsebnosti celokupnih fenolov Tabela 7-6: Deleţ MK v esktraktih, pridobljenih s CE s heksanom III

8 Seznam slik Slika 1-1: Značilnosti glive... 1 Slika 2-1: Dlakava slojevka... 5 Slika 2-2: Dišeča tramovka... 6 Slika 2-3: Bukova kresilka... 6 Slika 2-4: Pisana ploskocevka... 7 Slika 2-5: Sploščena ploščenka... 8 Slika 2-6: Smrekova kresilača... 8 Slika 2-7: Grbaste ploskocevke... 9 Slika 2-8: Kosmate ploskocevke... 9 Slika 2-9: Lekarniška macesnovka Slika 2-10: Brezova odpadljivka Slika 2-11: Reakcija prostega radikala DPPH z antioksidantom Slika 2-12: Ekstrakcijska naprava Slika 2-13: Shema ekstrakcije trdnih substanc Slika 2-14: Transesterifikacija triglicerida z alkoholom Slika 2-15: Razlika med nasičenimi in nenasičenimi MK Slika 2-16: Shematski prikaz GC Slika 3-1: Klasična ekstrakcija Slika 3-2: Mešanica; zgornja faza: heksan z raztopljenimi MK Slika 4-1: Vsebnost celokupnih fenolov Slika 4-2: Odstotek inhibicije DPPH v ekstraktih (% SD) Slika 4-3: Deleţ MK v ekstraktih trosnjakov Polyporaceae Slika 4-4: Deleţi MK v smrekovi kresilači IV

9 Izjava Izjavljam, da sem diplomsko delo izdelala sama, prispevki drugih so posebej označeni. Pregledala sem literaturo s področja diplomskega dela po naslednjih geslih: Vir: Science Direct ( Gesla: Število referenc Polyporaceae AND antioxidants AND health 84 Polyporaceae AND fatty acids AND gas chromatography 31 Vir: COBISS/OPAC ( COBIB.SI) Gesla: Število referenc Luknjarke 2 Maščobne kisline IN plinska kromatografija 40 Polyporaceae 6 Trosnjaki 9 Skupno število pregledanih člankov: 23 Skupno število pregledanih knjig: 14 Maribor, avgust 2016 Andreja Horvat V

10 »Nikoli ne smemo obupati nad našimi sanjami in upanji. Resda zna biti pot kamnita in zavita, toda svet pričakuje tisti poseben prispevek, za katerega je bil rojen vsak od nas.«marilyn Johnson Kondwani Zahvala Zahvaljujem se mentorju, red. prof. dr. Ţeljku Knezu, ki mi je omogočil opravljanje eksperimentalnega dela v laboratoriju za separacijske procese in produktno tehniko na Fakulteti za kemijo in kemijsko tehnologijo ter za strokovno pomoč in trud pri izdelavi moje diplomske naloge. Izredna zahvala gre tudi somentorici Dariji Cör, uni. dipl. inţ. kem. teh., za vse nasvete, prijaznost, potrpeţljivost, dostopnost in vso pomoč pri eksperimentalnem delu. Prav tako gre zahvala dr. Andreju Gregoriju in Antonu Sokliču, ki sta priskrbela gobe iz različnih lokacij po Sloveniji, jih fotografirala ter identificirala. Iskrena hvala moji druţini in prijateljem, ki so me podpirali, spodbujali in mi stali ob strani. Hvala vam, Andreja VI

11 Ekstrakcija biološko aktivnih spojin iz različnih vrst gob družine Polyporaceae (luknjarke) Povzetek Glavni namen diplomske naloge je bil pridobitev in analiza biološko aktivnih spojin ekstrakta iz različnih vrst gob druţine Polyporaceae (luknjarke). Osredotočali smo se na več vrst različnih gob, nabranih na različnih lokacijah po Sloveniji, na različnih vrstah plodišča ter različni nadmorski višini. Primerjali smo vpliv ţivljenjskega prostora določene vrste na izkoristek ekstrakcije ter vsebnost maščobnih kislin (MK). Raziskali smo, kakšni so izkoristki ( ) klasične ekstrakcije (CE) s heksanom, sledila je karakterizacija ekstraktov glede na tip MK s pomočjo plinske kromatografije (GC). Opravili smo 31 CE različnih gob iz omenjene druţine. Od tega smo analizirali 10 vrst tistih, ki se nahajajo v Sloveniji najpogosteje in kaţejo različne zdravilne učinke. Iz pridobljenih ekstraktov smo določali tudi vsebnost celokupnih fenolov in antioksidativno aktivnost (AOA) z DPPH metodo, kjer smo določali vsebnost biološko aktivnih snovi (fenolov, polisaharidov in proteinov). Pripravki iz raznih zdravilnih gob (sirupi, kapsule, čaji, oljni ekstrakti) uničujejo viruse in bakterije, izboljšajo prebavo, pomagajo pri alergijah ter premagovanju stresa in so učinkovita pomoč pri zdravljenju okuţb, grip, sladkornih bolezni, bolezni srca. Mnoge gobe zaradi svoje antioksidativnosti in velike vsebnosti polisaharidov, triterpenov ter drugih zdravilnih sestavin pomagajo v boju proti raku, izločajo strupene snovi iz organizma, krepijo imunski sistem in razstrupljajo telo, uravnavajo raven holesterola, zniţujejo krvni tlak in koncentracijo maščob v krvi, pripomorejo pa tudi k boljšemu počutju. Ugotovili smo, da so ekstrakti bogati z MK, fenoli in drugimi spojinami, ki so zelo dobri lovilci prostih radikalov. Rezultati prikazujejo zelo nizke odstotke inhibicije prostega radikala DPPH, zato lahko trdimo, da MK niso tako dobri antioksidanti kot nekatere fenolne spojine (FS). Ključne besede: Polyporaceae, trosnjaki, klasična ekstrakcija, maščobne kisline, transesterifikacija, plinska kromatografija, antioksidanti. UDK: : (043.2) VII

12 Extraction of biologically active compounds from Polyporaceae (bracket fungi) Abstract The main purpose of this thesis was to obtain and analyze the biologically active compounds from the extracts of different types of Polyporaceae family mushrooms. We focused on several different types of mushrooms gathered at various locations across Slovenia, on various types of fruiting bodies and different altitudes. We compared the influence of certain types of habitat on the efficiency of extraction and fatty acid content (FA). We tried to explore the efficiency ( ) of conventional extraction (CE) with hexane, followed by the characterization of the extracts according to the type of FA by gas chromatography (GC). We performed 31 CE on different mushrooms from the aforementioned family. Out of these 31, we analyzed 10 of the species most commonly found in Slovenia, which were showing various healing effects. We determined the total phenolic content and antioxidant activity using the DPPH method, where we researched the amount of biologically active substances (phenols, polysaccharides and proteins). The preparations made from various medicinal mushrooms (syrups, capsules, teas, oil extracts) help battle viruses and bacteria, improve digestion, help with allergies and overcoming stress and are very effective in the treatment of infections, influenza, diabetes, heart disease. Due to their antioxidant activities and the high levels of polysaccharides, triterpenes and other active ingredients, many mushrooms help in the fight against cancer; they also help remove toxins, strengthen the immune system and detoxify the body, regulate cholesterol levels, lower blood pressure and levels of lipids and improve the general wellbeing. We concluded that the extracts were rich in FA, phenols and other compounds that are excellent free radical scavengers. The results show a very low percentage of the DPPH free radical inhibition. Consequently, we can claim that the FA do not have as many antioxidative properties as some phenolic compounds. Key words: Polyporaceae, fruiting bodies, classical extraction, fatty acids, transesterification, gas chromatography, antioxidants UDK: : (043.2) VIII

13 Uporabljeni simboli in kratice Simboli A absorbanca [/] m masa [g] V volumen [L] t čas [min] T temperatura [ C] w masni deleţ [mg/g] q pretok [ml/min] Grški simboli izkoristek [%] omega [/] valovna dolţina [nm] masna koncentracija [g/l] Kratice AOA antioksidativna aktivnost (ang.: antioxidant activity) CE klasična ekstrakcija (ang.: classical extraction) DPPH prosti radikal 2,2-difenil-1-pikrilhidrazil EMK esencialne maščobne kisline (ang.: essential fatty acid) FAME metilni estri maščobnih kislin (ang.: fatty acids methyl esters) FC Folin-Ciocalteu reagent FID plamensko ionizacijski detektor FS fenolne spojine GA galna kislina GC plinska kromatografija (ang.: gas cromatography) GC-MS/FID plinska kromatografija z masno spektroskopijo s plamensko ionizacijskim detektorjem H 2 O voda MeOH metanol IX

14 MF MK MS MUFA SD SF SFA PUFA mobilna faza maščobne kisline (ang.: fatty acid - FA) masni spektrometer mononenasičene MK (ang.: monounsaturated fatty acids) standardna deviacija stacionarna faza nasičene MK (ang.: saturated fatty acids) polinenasičene MK (ang.: polyunsaturated fatty acids) X

15 1 Uvod Gobe spadajo v izredno veliko kraljestvo gliv, ki rastejo nad zemljo iz micelija, katerega sestavljajo prepletene nitke, imenovane hife. [1] Razmnoţujejo se spolno ali nespolno s trosi. Ko so trosi zreli, jih veter raznaša iz trosnjakov, ob ustrezni vlagi in toploti pa se na plodišču razvijejo iz podgobja v trosnjak oziroma gobo. Glive so heterotrofni organizmi, ki nimajo klorofila, da bi si iz CO 2 in H 2 O pod vplivom sončne svetlobe proizvajali sami svojo hrano, zato so odvisne od drugih organizmov. Največkrat jih najdemo na odmrlih rastlinah, ki jih razgradijo. [2] Slika 1-1: Značilnosti glive. Znano je, da če so gobe prave vrste, so gojene na pravi temperaturi in vlaţnosti ter pravi podlagi, lahko vsebujejo ogromno hranil in mnogo zdravilnih učinkov. Sveţa goba je vsebuje velik deleţ vode (do več kot 90 %), beljakovin (od 1,5 do 5 %), maščobnih kislin (0,3 %), ogljikovih hidratov (3,6 %), prav tako pa so bogate z vitamini (B1, B2, B3, E, D, K) in rudninskimi snovmi (kot so P, K, Zn, Cu, Fe, Na, Ca ). [3] Zaradi vseh teh sestavin so ţe starodavna ljudstva cenila vrednost gob in so bili mnenja, da so gobe»rastline nesmrtnosti«. [4] 1

16 Dandanes zdravilne gobe uporabljamo kot razna prehrambena dopolnila ali kot zdravila v obliki sirupov, tablet, kapsul, juh ter čajev. Dokazano je, da imajo gobe ogromno visokomolekularnih in zapletenih zdravilnih spojin (polisaharidi, triterpenoidi), ki krepijo imunski sistem, zavirajo nastanek rakavih celic in ščitijo telo pred bakterijskimi in virusnimi infekcijami. Polisaharidi so namreč po velikosti in teţi zelo podobni bakterijskim celicam, zato telo reagira z ustvarjanjem protiteles. Gobe vsebujejo ogromno polisaharida po imenu hitin, ki ga ljudje teţko prebavimo, zato moramo gobe pred zauţitjem prekuhati. Triterpeni so po zgradbi podobni steroidnim hormonom, ki nam najbolj pomagajo pri premagovanju stresa. [5] Novejše raziskave so v medicinskih gobah razkrile tudi ogromno antioksidantov (fenoli, amini) in adaptogenih učinkovin, ki izboljšajo odpornost telesu, uravnavajo raven holesterola, zniţujejo krvni tlak in koncentracijo maščob v krvi, pripomorejo pa tudi k boljšemu počutju. Gobe so zaradi svoje posebne celične zgradbe kljub visoki vsebnosti vode teţko prebavljive, zato jih ne smemo pojesti preveč. [6] V diplomskem delu smo poskušali raziskati, kakšni so izkoristki ekstrakcije trosnjakov gob z organskim topilom. V ta namen smo izvedli klasično ekstrakcijo (CE) z organskim topilom (n-heksan), sledila pa je karakterizacija ekstraktov glede na tip maščobnih kislin (MK) s pomočjo plinske kromatografije (GC). 2

17 2 Metode dela in materiali Za analizo in izdelavo diplomske naloge smo potrebovali različne tehnike in instrumente. Dr. Andrej Gregori in Anton Soklič sta nabrala, fotografirala ter identificirala več vrst gob iz druţine Polyporaceae. Imena vseh nabranih in identificiranih gob so zbrana v prilogi 1 v tabeli 7-1. Fotografije izbranih vrst so prikazane na slikah od 2-1 do Nabrane gobe smo pred ekstrakcijo ustrezno posušili ter nato zmleli do določene velikosti delcev. Zmleti kosi gob niso smeli biti prefini, saj bi se le-ti lahko povezali v večje delce, ki bi bili neprepustni za topilo. Izvedli smo CE pri temperaturi vrelišča topila (n-heksan) (T = 69 C). Goščo smo prefiltrirali, ekstrakt pa uparili. Na razpolago smo imeli 31 različnih vrst gob, ki smo jih ekstrahirali. Od tega smo desetim gobam, ki so znane po svojih zdravilnih učinkih, določali antioksidativno aktivnost (AOA) z radikalsko metodo, vsebnost fenolov in vsebnost MK. Zatehtali smo okrog 5 g materiala in mu dodali 100 ml topila (v razmerju 1:20). Izračunali smo ekstrakcij, ki so natančneje prikazani v prilogi 2. Iz pridobljenih ekstraktov smo si pripravili vzorce za analizo s GC, s pomočjo katere smo določevali MK. Podrobnejši rezultati izračunov vseh gob so zbrani v prilogah 2 in 3. Vse metode smo izvedli v laboratoriju za separacijske procese in produktno tehniko na Fakulteti za kemijo in kemijsko tehnologijo, Univerze v Mariboru. Laboratorijske metode: mletje materiala klasična ekstrakcija (CE) uparjanje transesterifikacija plinska kromatografija (GC) radikalska metoda 3

18 2.1 Polyporaceae Trosnjaki heterogene druţine Polyporaceae (luknjarke), prikazani v prilogi 1, so zelo razširjeni po celotni Evropi. Gre za veliko vrst gob, ki so različnih oblik in velikosti. Nahajajo se na drevesnih deblih, vejah ali tleh, kjer preţivijo več mesecev ali let. [2] Telesa trosnjakov so poličaste ali klasične oblike s klobukom in betom, ki štrlijo kot izrastki na drevesu ali pa so pritrjena na podlago. Trosovnice so iz majhnih luknjic ali cevk in so običajno bele ali rumene barve. Njihova naloga je razmnoţevanje in razširjanje trosov, ki se nahajajo v luknjicah na spodnji strani klobuka. [7] Gobe imajo običajno kratko ţivljenjsko dobo, vendar se lahko najdejo tudi vrste gob, katerih trosnjaki preţivijo več let. Večina luknjark je gniloţivk (saprofiti), kar pomeni, da dobijo hrano iz mrtvih organizmov tako, da razgradijo organske snovi, presnovne produkte pa nato vsrkavajo. Paraziti (zajedavske glive) rastejo na ţivih drevesih, jih zajedajo in povzročajo odmiranje. [1] Klasifikacija Polyporaceae je prikazana v tabeli 2-1, vrste luknjark pa najdemo v prilogi 1. Tabela 2-1: Klasifikacija Polyporaceae. [8] Znanstvena klasifikacija Kraljestvo: Deblo: Razred: Red: Druţina: Fungi (glive) Basidiomycota (prostotrosnice) Agaricomycetes (listarice) Polyporales (luknjičarji) Polyporaceae (luknjarke) Luknjarkam so ţe v preteklosti pripisovali zdravilno moč, saj so le-te predstavljale naravna zdravila, brez ali z redkimi nezaţelenimi stranskimi učinki. Zaradi velike vsebnosti zdravilnih sestavin so proizvajale antitumorske in zaviralne snovi ter spodbujale rast novih zdravih celic, prav tako pa bi naj pripomogle k boljšemu počutju. Kljub svojim zdravilnim učinkom je zelo malo gob te druţine uvrščenih med uţitne, predvsem zaradi njihove trde konsistence ter grenkega okusa. V nadaljevanju je opisanih nekaj gob, ki so znane po svojih zdravilnih učinkih. 4

19 2.1.1 Dlakava slojevka (Stereum hirsutum) S. hirsutum je neuţitna gniloţivka, ki jo najdemo na odmrlih listnatih drevesih (zlasti na hrastu) v vseh letnih časih. Ima polkroţno, pahljačasto obliko s tankimi, proţnostnimi klobuki. Premer trosnjaka se giblje med 3 in 10 cm. [7] Na površini se menjavajo ţametni koncentrični pasovi različnih barv, spodnja stran klobuka pa je gladka z valovitim robom, običajno rumene barve. Barva trosnega prahu je bela. [9] Pri ocenjevanju bioaktivnih spojin so odkrili, da je micelij S. hirsutum v ustreznih koncentracijah lahko dobro funkcionalno ţivilo, saj deluje antimikrobno. [10] Slika 2-1: Dlakava slojevka Dišeča tramovka (Gleophyllum odoratum) G. odoratum ima blazinaste, poličaste izrastke na osušenih lesnih delih iglavcev čez vso leto, široke vse do 20 cm in debele 2 5 cm. Klobuk je temno rjave barve z rumenim robom. Trosovnico sestavljajo majhne luknjice s trosi bele barve. Značilna je po prijetnem vonju po pomarančah, vendar je neuţitna. [2] Izvleček iz G. odoratum je dober antioksidant in deluje kot inhibitor, ki deaktivira delovanje rakavih celic in encimov, kot so: trombin, tripsin, cistein-proteaza. Izolirani triterpeni zmanjšujejo verjetnost tromboze. [11] 5

20 . Slika 2-2: Dišeča tramovka Bukova kresilka (Fomes fomentarius) Trdo telo neuţitne bukove kresilke je poličaste oblike, premera 5 50 cm in zajeda ţiva listnata drevesa (predvsem bukev in brezo). Površina trosnjaka je običajno sive barve, lahko je pa tudi belkasta ali svetlo rumena. Rjavo, ţilavo meso s svetlimi, podolgovatimi porami ima neprijeten vonj po sadju in oster okus. [2, 7] Ţe od nekdaj je znano, da se je njene trosnjake uporabljalo v različne namene. V zdravstvu se jih je uporabljalo za zdravljenje vraslih nohtov, celjenje ran, zaustavljanje krvavitev pri operacijah, pomirjanje ţivčnega sistema in krepitvi odpornosti telesa, notranjost gobe pa je bilo uporabno tudi za izdelavo oblačil in podobnih izdelkov (torbe, kape) ali pa za prenašanje ţerjavice. [9, 12] Ekstrakti odlično delujejo tudi v boju proti tumorjem in pri preprečevanju zunanjih vnetij. [13] Slika 2-3: Bukova kresilka. 6

21 2.1.4 Pisana ploskocevka (Trametes versicolor) T. versicolor uspeva kot saprofit na odmrlih deblih listnatih dreves v obliki tankih poličastih klobukov, ki spreminjajo barvo (modra, zelena, rdeča). Klobukovo meso je belo, ţilavo, brez posebnega vonja in okusa, rob klobuka pa je ščetinast. [7] V Sloveniji je ploskocevka ena najbolj raziskanih zdravilnih gob. [2] Zaradi lepega modrega odtenka ploskocevke večkrat uporabljajo za okraske in aranţmaje. [9] Kitajska ljudstva so jo posušeno ţe od nekdaj uporabljala za zdravljenje pljuč in dihal, goba pa koristi tudi kot antibiotik. [12] Zaradi velike vsebnosti polisaharidov (PSP in PSK) ima visoko stopnjo zaviranja rasti rakavih celic, hkrati pa krepi obrambno sposobnost telesa. [10, 13, 14] Slika 2-4: Pisana ploskocevka Sploščena pološčenka (Ganoderma applanatum) G. applanatum uspeva kot gniloţivka na drevesnih panjih ali odmrlih deblih v listnatih gozdovih. Rjav klobuk je ploščate polkroţne oblike z olesenelim mesom, ki ima grenak okus. Na spodnji strani klobuka je vrsta drobnih luknjic, ki prekrivajo belo trosovnico. Trosni prah je rjavi. [7] Imenujejo jo tudi»slikarska goba«, saj ob dotiku bela trosovnica na spodnji strani trosnjaka spremeni barvo v temno rjavo. [9] Tudi ta goba izboljšuje imunski sistem, deluje protivirusno in protitumorsko, uravnava prebavo, blaţi bolečine, uravnava krvni tlak in zaustavlja krvavitve. [12] 7

22 Slika 2-5: Sploščena ploščenka Smrekova kresilača (Fomitopsis pinicola) F. pinicola je večletna goba ploščate oblike, ki raste posamično ali ena nad drugo na odmirajočem lesu listavcev ali iglavcev. Zgornji del je temno rjave barve, blizu roba pa ima svetlo rumene in rdeče pasove. Trosovnica je sestavljena iz okroglih rumenih luknjic, trosi pa so bele barve. [2, 9] Trdo, ţilavo meso je neuţitno, neprijetnega vonja in okusa. Študije so pokazale, da deluje protivnetno in protibakterijsko, prav tako pa pomaga pri zdravljenju raka in hepatitisa. [12] Slika 2-6: Smrekova kresilača Grbasta ploskocevka (Trametes gibbosa) Ta neuţitna goba raste na odmrlih štorih listnatih dreves poleti in jeseni ter povzroča belo trohnobo. [2] Zgornja ploskev je običajno bele barve, starejše ploskocevke pa so značilne po svoji zeleni, z algami porasli površini, zato jih je skoraj nemogoče zamenjati. [9] Mesnati, tanki, polkroţni trosnjaki vsebujejo ţilavo meso s podolgovatimi porami. Premer trosnjaka je nekje med 5 in 20 cm, v višino pa lahko zraste do 8 cm. So brez vonja in brez okusa. [7] 8

23 Slika 2-7: Grbaste ploskocevke Kosmata ploskocevka (Trametes hirsuta) Poleti in jeseni povzroča T. hirsuta največjo škodo na štorih in hlodih listavcev. [2] Tanki, ploščati trosnjaki v obliki ledvice rastejo iz lesa in povzročajo belo trohnobo. Zgornji starejši del je dosti bolj opazen od roba klobuka, saj ima daljše ščetine in je porasel z algami. Spodnji del je obdan z oglatimi porami, ki se s časom spremenijo iz bele barve v sivkasto. [13] Tudi ekstrakt kosmate ploskocevke je znan po tem, da deluje proti bakterijam in virusom kot mnoge druge gobe te druţine. [15] Slika 2-8: Kosmate ploskocevke. 9

24 2.1.9 Lekarniška macesnovka (Laricifomes officinalis) L. officinalis je zajedalka in gniloţivka na iglavcih, predvsem na deblih macesna, ki raste skozi vse leto. [17] Barve na zgornji razpokani površini se prelivajo med belo, sivo, rumeno, rjavo, spodnji del pa sestavljajo bele luknjičaste trosovnice, iz katerih nastanejo pokončni stebrički. Največji trosnjaki tehtajo 10 kg ali več, njihovo meso pa je močnega, grenkega okusa. [10] Je zelo redka goba in spada med zaščitene gobe zaradi prekomerne prodaje v lekarah, kar nam pove ţe njeno ime. Zaradi velike vsebnosti polisaharida hitina, v katerem je do 16 % agaricinske kisline, so jo uporabljali za zdravljenje tuberkuloze in bronhitisa, koristila pa naj bi tudi pri pomirjanju in premagovanju stresa. Goba deluje odvajalno, njen prah pa so uporabljali tudi za ustavljanje krvavitev in celjenje ran. [12]»Agarikon«ni samo močno protivnetno in antibakterijsko sredstvo, njeni izvlečki kaţejo tudi protivirusne lastnosti. [17] Slika 2-9: Lekarniška macesnovka Brezova odpadljivka (Piptoporus betulinus) Brezova odpadljivka je poličasto vezana na stoječa debla dreves, predvsem na starih brezah, in dobro uspeva v hladnem podnebju. [2] Rjavi, polkroţni trosnjak je brez beta, meso klobuka je belo in mehko. [9] Goba sicer ni škodljiva, vendar njen grenek okus ne pritegne veliko ljudi. V preteklosti so njen prah uporabljali za ustavljanje krvavitev, preprečevanje infekcije in celjenje ran, danes pa se uporablja le še za pomiritev ţivcev, krepitev imunskega sistema ali odpravo utrujenosti. Raziskave so pokazale, da vsebujejo več zdravilnih sestavin, kot so triterpeni, fungisteroli in ergosteroli, potrdili pa so tudi prisotnost nukleinskih kislin v izvlečkih, ki so sposobni onesposobiti viruse in bakterije. [12] 10

25 Slika 2-10: Brezova odpadljivka. 2.2 Antioksidanti Hranilne snovi v našem organizmu izgorevajo zaradi vdihanega kisika in tako dobimo zadostno energijo za svoje delovanje. Ko organska snov reagira z zračnim kisikom, poteče oksidacija 1 in nastanejo nepotrebne, škodljive spojine prosti radikali. Nastale snovi so reaktivne in nestabilne, hitro reagirajo z molekulami v našem telesu, posledično pa povzročijo poškodbe celic in številne bolezni. S pomočjo ustreznih dodatkov v našem telesu lahko preprečimo vezavo O 2 na molekule oz. zaviramo takšne nekontrolirane oksidativne procese, ki povzročajo staranje organizma, različna rakasta obolenja, nevrodegenerativne bolezni (demenca, Alzheimerjeva in Parkinsonova bolezen), aterosklerozo, bolezni srca in oţilja ter nam oslabijo imunski sistem. Takim dodatkom pravimo antioksidanti. [18, 19] Antioksidanti ali»lovilci prostih radikalov«so organske spojine, ki se veţejo na proste radikale, ki nastanejo kot stranski produkt celičnega dihanja, in s tem preprečijo, da bi le-ti reagirali z molekulami v našem telesu. [20] Med najpomembnejše antioksidante spadajo: vitamini A ( -karoten), E in C, ki jih v telo vnašamo s hrano (sadje, zelenjava, oreščki), v obliki prehrambenih dopolnil ali kar s kozmetičnimi izdelki; minerali (Se, Mn, Zn, Cu, Fe, Cr), ki ne delujejo neposredno; flavonoidi, karotenoidi, koencim Q10, izoflavonoidi, fenolne spojine (polifenoli) [21] Dokazano je, da uţivanje večjih količin antioksidantov zmanjšuje oziroma preprečuje kronične in degenerativne bolezni. [20] 1 Oksidacija ali»spajanje«elementov s kisikom. 11

26 Med različnimi viri antioksidantov imajo gobe pomembno vlogo, saj izvlečki iz micelija ali trosnjakov kaţejo antioksidativne lastnosti. Ekstrakti so bogati s polisaharidi, triterpeni, polifenoli in proteini. Raziskave so pokazale, da gobe zaradi svojih lastnosti upočasnjujejo oksidacijo molekul, ki jih povzroča vezava prostih kisikovih intermediatov. So zelo dobri antioksidanti in delujejo proti mnogim boleznim današnjega časa. [22] AOA je sposobnost spojine, ki temelji na oksidaciji in nestabilnih intermediatih, ki sodelujejo v procesu. Določamo jo lahko direktno ali indirektno. Ena izmed najstarejših metod je indirektna metoda z uporabo stabilnega prostega radikala DPPH, ki ni topen v vodnih raztopinah, zato se AOA meri v metanolu (MeOH). Ko DPPH reagira z antioksidantom, dobimo DPPH 2 v reducirani obliki, ki povzroči spremembo barve iz močno vijolične v svetlo rumeno. [23] Slika 2-11: Reakcija prostega radikala DPPH z antioksidantom. 12

27 2.3 Ekstrakcija trdno tekoče Ekstrakcija je separacijski postopek, v katerem gre za ločevanje topnih komponent iz trdnih ali tekočih zmesi s primernim topilom. [24] Slika 2-12: Ekstrakcijska naprava. CE poteka na tak način, da se zmes in topilo med seboj mešata (slika 2-12). Snovi, ki se topijo v ekstrakcijskem sredstvu, začnejo prehajati v topilo. Pridobljena snov je ekstrakt oziroma izvleček. [25] Pri ekstrakcijskem procesu moramo upoštevati naslednje štiri dejavnike, ki vplivajo na potek ekstrakcije: temperatura: Topnost komponente v večini primerih narašča s temperaturo, zato narašča ekstrakcijska hitrost. velikost delcev: Majhni, fini delci lahko ovirajo separacijo delcev ali fluida in se lahko sprimejo v večje delce ter posledično ovirajo pretok fluida. topilo: Pri masti, olju kot ekstrakcijska sredstva uporabljamo hlapna organska topila, pri pridobivanju vodotopnih snovi pa vodo. Izbrano topilo mora biti selektivno z nizko viskoznostjo. mešanje: Z mešanjem preprečujemo sesedanje delcev. [26] 13

28 Shema ekstrakcije trdnih substanc je prikazana na sliki Slika 2-13: Shema ekstrakcije trdnih substanc. [26] 2.4 Transesterifikacija Pri mehanizmu transesterifikacije gre za zamenjavo organskih skupin med alkoholom in estrom. [27] Ravnoteţna reakcija transesterifikacije se običajno uporablja za razgradnjo maščob ob dodatku ustreznega katalizatorja (encima lipaze), ki pospeši reakcijo. Vsako maščobo sestavljajo 3 MK in glicerol (propan-1,2,3-triol), povezani z estrsko vezjo, zato maščobam rečemo tudi trigliceridi. [28] Razgradnja trigliceridov (slika 2-14) poteka v treh zaporednih stopnjah, ob vsaki stopnji pa se tvori ena molekula estra. Tako dobimo tri molekule maščobnih estrov in glicerol, sladkorni alkohol kot stranski produkt. [29] 14

29 Slika 2-14: Transesterifikacija triglicerida z alkoholom. [29] Maščobe spadajo v skupino organskih spojin (med lipide) in so nujne za normalno delovanje našega telesa, saj imajo pomembno vlogo pri skladiščenju energije, zaščiti izolacijske plasti pod koţo in so sestavine mnogih presnovnih procesov. Odvisne so od dolţine (št. C-atomov) in nasičenosti verig (št. dvojnih vezi) MK (na sliki 2-14 so označene z R 1, R 2 in R 3 ) v različnih razmerjih. V naravi se ne srečamo z maščobami iz enakih MK. Če se maščobe ali olja v hrani razcepijo, nastanejo MK, ki so poglavitni sestavni del lipidov. [30] Poznamo (slika 2-15): nasičene maščobe živalskega izvora, ki so brez dvojnih vezi, H-atomi pa so enakomerno porazdeljeni na vsakem C-atomu, nenasičena rastlinska olja, ki vsebujejo vsaj eno dvojno vez in nimajo enakomerno porazdeljenih H-atomov. [31] Nasičenim (SFA) lahko rečemo tudi»slabe«maščobe in so najmanj zaţelene, saj preveliki deleţi SFA povzročijo povišano vsebnost holesterola v krvi, srčno kap, debelost, nevrološke in druge srčno-ţilne bolezni. Če pride do zamašitev ţil, kisik ne potuje do srca, zato srce enostavno odpove. Kljub temu da SFA spadajo pod»slabe«maščobe, jih vsaka celica našega telesa potrebuje za delovanje. 50 % SFA je v vsaki celični membrani. Prispevajo k zgradbi in funkciji pljuč, srca, kosti, jeter ter imunskega sistema. V naših pljučih se nahaja ena takšnih maščob, t. i. palmitinska MK (C16:0), ki preprečuje astmo in druge dihalne motnje. Tudi naša jetra nas s pomočjo SFA varujejo pred slabimi učinki toksinov, med njimi tudi alkohola. [20] 15

30 Nasprotno pa poznamo nenasičene,»dobre«maščobe in jih moramo čim več vključiti v prehrano. Nenasičene maščobe lahko najdemo v naravni cis obliki, ki jih naše telo potrebuje, ali v trans obliki, ki so za telo tako škodljive kot nasičene maščobe. Najbolj znani sta oleinska mononenasičena MK (MUFA) (C18:1-9), ki ima eno dvojno vez ter linolenska (C18:3-3) in linolna (C18:2-6) polinenasičeni MK (PUFA) z dvema dvojnima vezema. [31] Oleinska MK inhibira sproščanje histamina, to pa je pomembno za zdravljenje vnetja in alergij. [32] Linolna in linolenska MK spadata pod EMK in sta nujno potrebni za človeški organizem, vendar ju naš organizem sam ne more proizvesti. nasičena MK HO O nenasičena MK HO CH 3 O dvojna vez CH 3 Slika 2-15: Razlika med nasičenimi in nenasičenimi MK. Maščobe so nujna sestavina v človeški prehrani, saj telo potrebuje nekatere MK (nenasičene MK z več dvojnimi vezmi), ki jih samo ne more proizvesti esencialne maščobne kisline (EMK). Le-te imajo v našem telesu izreden pomen, saj delujejo kot antioksidanti, kljub temu pa jim škodi kakršnokoli izpostavljanje visokim temperaturam (pri kuhanju, peki, hidrogenizaciji ali pri rafinaciji, kjer odstranjujejo nečistoče iz izvlečkov). Pri obdelavi namreč popolnoma spremenijo svojo obliko in značaj, kar pa lahko postane zdravju škodljivo (trans MK). [31] Prav tako v prisotnosti zračnega O 2 zelo hitro oksidirajo in tvorijo proste radikale. Zelo pomembno vlogo imajo tudi olja, ki so bogata z omega-3 ( -3) in omega-6 ( -6) maščobami. Uţivati bi jih morali v pribliţno enakih količinah, vendar dandanes zaradi nepravilne prehrane v jedilnikih prevladujejo -6 maščobe, zmanjšal pa se je vnos zdravih -3 maščob, ki godijo moţganom, zato je tudi večja moţnost, da se razvije demenca. [20] 16

31 V tabelah 2-2 in 2-3 so podane najpogostejše SFA, MUFA in PUFA. Tabela 2-2: Najpogostejše nasičene MK. Sistematično ime kisline Splošno ime kisline Kemijska formula Skrajšana oznaka butanojska butirična CH 3 (CH 2 ) 2 CO 2 H C 4:0 pentanojska valerinska CH 3 (CH 2 ) 3 CO 2 H C 5:0 heksanojska kapronska CH 3 (CH 2 ) 4 CO 2 H C 6:0 heptanojska enantionjska CH 3 (CH 2 ) 5 CO 2 H C 7:0 oktanojska kaprolna CH 3 (CH 2 ) 6 CO 2 H C 8:0 nonanojska pelargonska CH 3 (CH 2 ) 7 CO 2 H C 9:0 dekanojska kaprična CH 3 (CH 2 ) 8 CO 2 H C 10:0 hendekanojska undecilinska CH 3 (CH 2 ) 9 CO 2 H C 11:0 dodekanojska lavrinska CH 3 (CH 2 ) 10 CO 2 H C 12:0 tridekanojska tridecilinska CH 3 (CH 2 ) 11 CO 2 H C 13:0 tetradekanojska miristinska CH 3 (CH 2 ) 12 CO 2 H C 14:0 pentadekanojska pentadecilinska CH 3 (CH 2 ) 13 CO 2 H C 15:0 heksadekanojska palmitinska CH 3 (CH 2 ) 14 CO 2 H C 16:0 heptadekanojska margarinska CH 3 (CH 2 ) 15 CO 2 H C 17:0 oktadekanojska stearinska CH 3 (CH 2 ) 16 CO 2 H C 18:0 eikozanojska arahidinska CH 3 (CH 2 ) 18 CO 2 H C 20:0 dokozanojska beheninska CH 3 (CH 2 ) 20 CO 2 H C 22:0 tetrakozanojska lignocerinska CH 3 (CH 2 ) 22 CO 2 H C 24:0 heksakozanojska cerotinska CH 3 (CH 2 ) 24 CO 2 H C 26:0 oktakozanojska montaninska CH 3 (CH 2 ) 26 CO 2 H C 28:0 triakontanojska melisicinska CH 3 (CH 2 ) 28 CO 2 H C 30:0 tritriakontanojska psilicinska CH 3 (CH 2 ) 31 CO 2 H C 33:0 Tabela 2-3: Najpogostejše nenasičene MK prisotne v naravi. Sistematično ime kisline Splošno ime kisline Skrajšana oznaka dec-9-enojska / C 10:1 dodec-9-enojska / C 12:1 tetradec-9-enojska miristoleinska C 14:1 heksadec-9-enojska palmitoleinska C 16:1 17

32 oktadec-6-enojska petroselinska C 18:1 oktadec-9-enojska oleinska C 18:1 n-9 oktadec-11-enojska vaceninska C 18:1 n-7 oktadeka-9:12-dienojska linolna C 18:2 n-6 oktadeka-9:12:15-trienojska α-linolenska C 18:3 n-3 oktadeka-6:9:12-trienojska -linolenska C 18:3 n-6 oktadeka-9:11:13-trienojska eleostearinska C 18:3 eikosa-9-enojska gadoleinska C 20:1 eikosa-5:8:11:14-tetraenojska arahidonska C 20:4 n-6 eikosa-5:8:11:14:17-pentaenojska EPA C 20:5 n-3 dokoza-13-enojska eruična C 22:1 dokoza-7:10:13:16:19-pentaenojska DPA C 22:5 n-3 dokoza-13:16:19-heksaenojska DHA C 22:6 n-3 Za laţje prepoznavanje maščob si pomagamo z označevanjem MK z IUPAC ali trivialnim imenom ter s simbolom. MK so sestavljene iz verige ogljikov z enojno ali dvojno vezjo. Če vsebujejo dve ali več dvojnih vezi, je lokacija le-teh izredno pomembna. -6 EMK imajo dvojno vez na šestem ogljikovem atomu (C-atom) od konca verige MK, -3 pa na tretjem C- atomu. Primer: linolna kislina (IUPAC ime: cis,cis-9,12-oktadekadienojska kislina; oznaka: C 18:2, n-6) je nenasičena -6 EMK z 18 C-atomi in dvema dvojnima vezema. 18

33 2.5 Plinska kromatografija GC je postopek ločevanja plinastih ali uplinjenih zmesi. Snovi, ki jih ločujemo, se porazdelijo v dve fazi. Ena je stacionarna faza (SF), ki se v procesu ne premika, druga je mobilna faza (MF), ki se premika. SF je lahko drobno zmleta trdnina ali kapljevina. MF je lahko kapljevina, ki se s SF ne meša, ali plin, ki se v SF ne topi. MF pri GC je inertni plin (helij, argon, dušik), ki se ne veţe na SF. [25] Izbira SF je najpomembnejša naloga GC in je odvisna od tega, kakšen vzorec analiziramo. Za nepolarne vzorce uporabljamo nepolarno SF, za polarne vzorce pa polarne SF. Nosilni plin (MF) ima to nalogo, da nosi vzorec skozi kolono v detektor. Slika 2-16: Shematski prikaz GC. [33] Inertni plin (MF) odnaša vzorec (zmes spojin), ki se ga injicira v komoro, v kromatografsko kolono, napolnjeno z nosilcem SF (običajno aktivno oglje, aluminijev oksid). Kolona je najpomembnejši del aparata za GC, saj se v njej loči plinska zmes. Ostali deli aparata sluţijo le za kontrolo. Spremembe se preko ojačevalnika preoblikujejo v zapis, ki mu pravimo plinski kromatogram. Ločene snovi v kromatogramu zaznamo v obliki pikov. Površina pikov je sorazmerna količini snovi. [34] 19

34 3 Eksperimentalni del 3.1 Laboratorijski pribor, aparature in kemikalije Steklovina in pribor bučka z okroglim dnom ţlička magnetno mešalo merilni valj (100 ml) filtrni papir steklene viale za ekstrakte steklene viale za vzorce (2 ml) nuča z nastavkom za nučiranje in gumico povratni hladilnik termometer steklena pipeta epruvete spatula avtomatske pipete temne stekleničke (10 ml) merilna bučka (10 ml) Aparature kavni mlinček za mletje laboratorijska tehtnica uparjalnik (rotavapor) grelnik analitska tehtnica ultrazvočna kopel spektrofotometer 20

35 Kemikalije n-heksan destilirana voda 0,5 M H 2 SO 4 v MeOH NaOH plinasti N 2 MeOH 2,2-difenil-1-pikrilhidrazil (DPPH) Folin-Ciocalteu reagent (FC) galna kislina (GA) natrijev (V) karbonat (Na 2 CO 3 ) 3.2 Priprava materiala Dr. Andrej Gregori in Anton Soklič sta nabrala več različnih gob druţine Polyporaceae na različnih lokacijah po Sloveniji. Trosnjake smo narezali na manjše kose in jih posušili na sobni temperaturi do 30 C. Posušene trosnjake smo nato zmleli z mlinčkom do določene velikosti delcev ter jih hranili na suhem mestu do ekstrakcije. 3.3 Klasična ekstrakcija (CE) s heksanom Naloge smo se lotili tako, da smo zatehtali 5 g suhih in zmletih trosnjakov Polyporaceae v bučko z okroglim dnom, dodali 100 ml n-heksana. CE smo izvedli pri temperaturi vrelišča topila (T = 69 C). CE je potekala 3 ure, nato smo s pomočjo nuče prefiltrirali ekstrakcijsko zmes. Dobljeno raztopino ekstrakta smo uparili s pomočjo rotavaporja, vendar ne do suhega. V predhodno stehtane steklene viale smo nato prelili koncentriran ekstrakt. Sledilo je prepihovanje z dušikom (N 2 ) z namenom, da uparimo ostanek topila in dobimo suho maso ekstrakta. Na koncu smo ponovno stehtali viale in tako določili maso ekstrakta in izkoristek CE. Izkoristek ekstrakcije [%] in maso ekstrakta [mg] smo izračunali po naslednjih enačbah: mekst. (%) 100 (3.1) m m mat. ekst. mviala ekst. mviala (3.2) 21

36 Kjer je: izkoristek [%] m ekst. m mat. m viala+ekst. m viala masa ekstrakta [g] masa zatehtatih zmletih trosnjakov [g] masa viale in ekstrakta [g] masa viale [g] 3.4 Biološka analiza ekstraktov Slika 3-1: Klasična ekstrakcija. Določanje antioksidativne aktivnosti (AOA) z radikalsko metodo AOA ekstraktov smo določali z uporabo DPPH. V 10 ml bučko smo natehtali 10 mg vzorca in ga raztopili v MeOH do oznake, saj DPPH v H 2 O ni topen. Vzorec smo dobro premešali (po potrebi smo uporabili tudi ultrazvočno kopel), da se je ves DPPH raztopil. Pripravili smo si MeOH razt. DPPH s koncentracijo 1 mg/ml. V temno stekleničko smo odpipetirali 3 ml razt. DPPH in 77 l razt. ekstrakta ter vse skupaj termostatirali 15 min pri stalni temperaturi v temnem prostoru. S spektrofotometrom smo nato izmerili absorbanco (A) raztopine ( = 515 nm). Za umerjanje smo po enakem postopku pripravili tudi referenčno razt., le da smo namesto razt. vzorca odpipetirali 77 l MeOH in takoj izmerili A. 22

37 AOA [% inhibicije glede na referenčno razt.] smo izračunali po naslednjih enačbah: 0 15 A C AS inhibicije 100 (3.3) AC % 0 Kjer je: A c 0 A s 15 absorbanca referenčne raztopine v t = 0 min absorbanca raztopine vzorca v t = 15 min 3.5 Kemijska analiza ekstraktov Določanje vsebnosti skupnih fenolov Vsebnost celokupnih fenolov smo določili na osnovi oksidacijske reakcije FS s Folin- Ciocateu-jevim (FC) reagentom z merjenjem A nastalega barvnega kompleksa s spektrofotometrom pri valovni dolţini 760 nm. Kot standard smo uporabili galno kislino (GA). Najprej smo si pripravili osnovno raztopino GA v destilirani vodi konc. 0,4 mg/ml. V 10 ml bučke smo odpipetirali po: 7,5 ml, 5,0 ml, 3,5 ml, 1,0 ml, 0,75 ml, 0,5 ml, 0,25 ml in 0,1 ml GA ter razredčili z destilirano H 2 O do oznake. Iz vsake smo odpipetirali po 0,5 ml raztopine GA, dodali 2,5 ml FC reagenta (razredčimo z destilirano H 2 O v razmerju 1:10) ter 2 ml Na 2 CO 3 s konc. 75 g/l. Pripravljene vzorce smo termostatirali na vodni kopeli 5 min pri 50 C, nato smo jim izmerili A pri 760 nm. [36] Iz pripravljene razt. ekstrakta s konc. 1 mg/ml smo odpipetirali 0,5 ml razt. ekstrakta in dodali 2,5 ml razt. FC reagenta ter 2 ml Na 2 CO 3. Za slepi vzorec smo uporabili destilirano H 2 O. Enak postopek smo uporabili še za preostale ekstrakte. Vzorce smo pustili na vodni kopeli 5 min pri 50 C. Ohlajenim vzorcem smo s spektrofotometrom izmerili A. S pomočjo predhodne umeritvene krivulje z GA smo izračunali konc. totalnih fenolov v ekstraktih [mg GA/g ekst.] po sledečih enačbah: Abs b Abs a GA b GA (3.4) a m ekstrakt ekstrakt (3.5) Vrazt. 23

38 w GAekstrakt GA ekstrakt 100 (3.6) Kjer je: Abs absorbanca (A) razt. vzorca izmerjena pri 760 nm [/] B odsek premice umeritvene krivulje GA na osi absorbance [/] A GA ekstrakt w GAekstrakt naklon premice umeritvene krivulje GA [ml/mg] konc. GA v razt. ekstrakta [mg/ml] konc. ekstrakta v razt. vzorca [mg/ml] vsebnost totalnih fenolov [mg GA/g ekst.] Določevanje vsebnosti maščobnih kislin (MK) Za ustrezno določevanje vsebnosti MK smo si morali pripraviti vzorce za analizo z GC z masno spektroskopijo s plamensko ionizacijskim detektorjem (GC-MS/FID). V stekleno vialo (2 ml) smo zatehtali ekstrakt, ki smo ga razredčili v heksanu. Predhodno smo si pripravili 0,5 M H 2 SO 4 v MeOH in je dodali 1 ml v vialo ter dobro premešali. Vse skupaj smo postavili v vodno kopel, ogreto na 50 C za 60 min. Ko je reakcija potekla, smo s pomočjo 0,5 M NaOH nevtralizirali naš vzorec do ph 7. Značilno za maščobe je, da se v vodi ne topijo, se pa topijo v organskih, nepolarnih topilih, zato smo mešanico dodatno trikrat sprali s heksanom, da sta se fazi ločili med seboj. S stekleno pipeto smo odvzeli zgornjo fazo heksana z raztopljenimi MK (slika 3-2) in jo prepihali z N 2, da smo dobili naše koncentrate, ki smo jih ponovno stehtali pri sobni temperaturi. Enak postopek smo uporabili še za preostale ekstrakte. Slika 3-2: Mešanica; zgornja faza: heksan z raztopljenimi MK. 24

39 Iz pridobljenih vzorcev smo nato s pomočjo GC-MS/FID določili vsebnost MK v ekstraktih. 1 l vzorca smo injicirali v MS (GC-DSQ II; Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, ZDA) s FID detektorjem. FID deluje pri visokih temperaturah ( C), kar preprečuje kondenzacijo H 2 O in organskih snovi z višjim vreliščem. Dokler prehaja skozi kolono samo MF, je ionski tok majhen. Ko pa pride iz kolone še vzorec (organska snov), se ionski tok ojača in ga lahko natančneje izmerimo. Nosilni plin (MF) je bil helij (q = 1,4 ml/min), temperatura injektorja ter MS je bila 250 C. Začetna temperatura v pečici je bila 50 C, nato pa se je postopoma povečevala za 25 C do 230 C. Končno temperaturo smo vzdrţevali 25 min. Za identifikacijo metilnih estrov MK (FAME) smo uporabili naslednje standarde: PUFA-3 (polinenasičene MK), FIM-FAME-7 (mešanica metilnih estrov) in mikrobiološko standardno mešanico (bacterial acid methyl ester CP mixture). [22] 25

40 4 Rezultati in diskusija Vemo, da gobe vsebujejo veliko zdravih sestavin, zato smo se v diplomski nalogi osredotočali na biološko aktivne snovi, ki so prisotne v trosnjakih. Ekstrahirali smo 31 različnih vrst gob druţine Polyporaceae, iz pridobljenih ekstraktov pa smo pripravili vzorce za analizo. Vse uporabljene vrste gob so prikazane v prilogi 1. V nadaljnjih analizah smo se bolj osredotočili na 10 gob (Stereum hirsutum, Gleophyllum odoratum, Fomes fomentarius, Trametes versicolor, Ganoderma applanatum, Fomitopsis pinicola, Trametes gibbosa, Trametes hirsuta, Laricifomes officinalis, Piptoporus betulinus), ki so najbolj znane po svojih zdravilnih učinkih, in jim z uporabo prostega radikala DPPH določili AOA, zanimala pa nas je tudi vsebnost FS in MK. Tabela 4-1: 10 zdravilnih gob druţine Polyporaceae in rezultati analiz. [%] Inhibicija DPPH [%] Celokupni fenoli [mg GA/g ekst.] Stereum hirsutum 0,542 1, ,5 Gleophyllum odoratum 0,531 3, ,6 Fomes fomentarius 0,898 5, ,6 Trametes versicolor 1,775 0,3802 9,3 Ganoderma applanatum 0,842 2, ,3 Fomitopsis pinicola 6,445 5, ,6 Trametes gibbosa 0,824 3, ,8 Trametes hirsuta 0,448 2, ,5 Laricifomes officinalis 5,215 2, ,7 Piptoporus betulinus 1,627 3, ,3 Študije so pokazale, da je izkoristek CE ( ) odvisen od temperature in od vrste topila. [22] V našem primeru smo za topilo izbrali nepolarni heksan, ki se uporablja predvsem za izolacijo MK, ki so nepolarne. Po končani CE smo izračunali po enačbi 3.1, vsi rezultati pa so zbrani v tabelah 4-1 in 7-2 (priloga 2). Najvišji CE smo dobili pri gobi Fomitopsis pinicola, ki znaša 6,445 %. Najniţji CE (le 0,448 %) ima Trametes hirsuta. Ker je pri vseh precej nizek, smo predvidevali, da je v trosnjakih Polyporaceae nizki deleţ MK. 26

41 Vsebnost totalnih fenolov [mg GA/g ekst.] Ekstrakcija biološko aktivnih spojin iz različnih vrst gob druţine Polyporaceae (luknjarke) 4.1 Določanje vsebnosti skupnih fenolov Da bi ugotovili vsebnost fenolov (w GAekstrakt ), smo našim vzorcem s konc. 1 mg/ml dodali ustrezno konc. FC reagenta in Na 2 CO 3 ter s pomočjo predhodne umeritvene krivulje z GA po enačbah 3.4, 3.5 in 3.6 izračunali deleţ totalnih fenolov v ekstraktih. Vsebnost FS v ekstraktih trosnjakov Polyporaceae smo podali kot mg GA na g ekstrakta (mg GA/g ekst. SD). Na sliki 4-1 so prikazane vrednosti fenolov v gramu ekstraktov. 25 Celokupni fenoli 20 18,6 19, ,5 14,6 9,3 12,3 13,8 13,5 13,7 14,3 5 0 Stereum hirsutum Gleophyllum odoratum Fomes fomentarius T. versicolor Ganoderma applanatum Vzorec Fomitopsis pinicola T. gibbosa T. hirsuta Laricifomes officinalis Piptoporus betulinus Slika 4-1: Vsebnost celokupnih fenolov. Največ fenolov vsebujeta trosnjaka Fomitopsis pinicola (19,6 mg GA/g ekst.) in Fomes fomentarius (18,6 mg GA/g ekst.), najmanj pa jih najdemo v Trametes versicolor (9,3 mg GA/g ekst.) ter Stereum hirsutum (11,5 mg GA/g ekst.). Vrednosti padajo v naslednjem vrstnem redu: G. odoratum (14,6 mg GA/g ekst.), P. betulinus (14,3 mg GA/g ekst.), T. gibbosa (13,8 mg GA/g ekst.), L. officinalis (13,7 mg GA/g ekst.), T. hirsuta (13,5 mg GA/g ekst.) in G. applanatum (12,3 mg GA/g ekst.). Raziskave so pokazale nizke vsebnosti skupnih fenolov v ekstraktih, pridobljenih v heksanu, saj se le-ta uporablja predvsem za ekstrakcijo MK. [35] FS so znani naravni antioksidanti, ki zaustavljajo oksidacijo lipidov in zavirajo rast velikega št. bakterij, preprečujejo oksidacijo LDL 2 in pripomorejo k boljšemu počutju. [20] Velik vpliv na antioksidacijsko sposobnost 2 LDL je»slabi«holesterol. 27

42 Inhibicija DPPH [%] Ekstrakcija biološko aktivnih spojin iz različnih vrst gob druţine Polyporaceae (luknjarke) ima poloţaj in razporeditev hidroksilnih ( OH) skupin na orto mestu ter delokalizacija elektrona po aromatskem obroču, kar zagotavlja stabilnost. Znano je, da FS zelo rade oksidirajo, so lovilci prostih radikalov ter inhibitorji oksidacijskih encimov. Večja kot je vsebnost FS v samem ekstraktu, večja je AOA. [22, 36] 4.2 Določanje AOA z radikalsko metodo (DPPH ) Pripravili smo si razt. vzorcev s konc. 1 mg/ml in izmerili njihovo A v 15 min. (A 15 S ). Začetna A referenčne razt. (A 0 15 C ) je bila 0,5786. Iz A S in A 0 C smo po enačbi 3.3 izračunali inhibicijo DPPH. AOA ekstraktov, pridobljenih iz trosnjakov Polyporaceae, smo podali kot % zaviranja DPPH ( SD). Rezultati so nazorneje prikazani na sliki 4-2 in v tabeli 7-4 (Priloga 4). AOA 6 5 5,06 5,24 4 3,46 3,25 3, ,14 2,06 2,21 1 1,11 0,38 0 Stereum hirsutum Gleophyllum odoratum Fomes T. versicolor Ganoderma fomentarius applanatum Fomitopsis pinicola T. gibbosa T. hirsuta Laricifomes officinalis Piptoporus betulinus Vzorec Slika 4-2: Odstotek inhibicije DPPH v ekstraktih (% SD). Najvišjo vrednost inhibicije DPPH smo dobili pri trosnjaku Fomitopsis pinicola (5,24 %) in Fomes fomentorius (5,06 %), najniţjo pa pri Trametes versicolor (0,38 %) ter Stereum hirsutum (1,11 %). Pri ostalih gobah se vrednosti gibljejo med 2 % ter 3,5 % (v padajočem vrstnem redu: G. odoratum (3,46 %), P. betulinus (3,28 %), T. gibbosa (3,25 %), L. officinalis (2,21 %), G. applanatum (2,14 %) in T. hirsuta (2,06 %)). 28

43 Če primerjamo dobljene rezultate totalnih fenolov (slika 4-1) ter inhibicije DPPH (slika 4-2) vidimo, da so rezultati na prvi pogled zelo podobni. Najvišjo inhibicijo DPPH smo dobili pri ekstrakciji F. pinicola, kjer smo določili tudi najvišjo vsebnost FS. Podobno velja za ostale ekstrakte. V našem primeru višje vsebnosti celokupnih fenolov odraţajo višjo inhibicijo DPPH, ni pa vedno tako. Vrednosti celokupnih fenolov in inhibicije DPPH so relativno nizke, saj je heksan izrazito nepolarno topilo, s katerim uspemo ekstrahirati samo nepolarne komponente. Kljub temu lahko iz danih rezultatov sklepamo, da so v ekstraktih pridobljenih s heksanom v manjši meri zastopane tudi polarne komponente, kar se odraţa v stopnji inhibicije ter v vrednosti celokupnih fenolov. 4.3 Določevanje vsebnosti MK Gobe vsebujejo mnogo zdravilnih sestavin (polisaharidi, steroli, steroidi, terpeni itd.), v majhni količini pa najdemo tudi MK. Sestavljene so iz C, H in O in običajno vsebujejo od 12 do 22 C-atomov. Dolge MK (14 24 C-atomov), ki so najpogostejše v prehrani, so palmitinska (C16:0), stearinska (C18:0), arahidinska (C20:0), oleinska (C18:1-9) in linolna (C18:2-6). [22] Po CE s heksanom smo dobili olje, bogato z MK. Zanimal nas je deleţ teh MK v %, zato smo izvedli metilno esterifikacijo, pri čemer so nastali FAME. S pomočjo GC smo dobili kromatograme, na katerih smo primerjali retenzijske čase 3 in masne spektre ter tako določili MK, ki so prevladovale v določenem vzorcu. Iz ekstraktov smo identificirali 19 MK, od tega 10 nasičenih (SFA) in 9 nenasičenih MK (MUFA in PUFA), ki vsebujejo od 14 do 24 C-atomov. Primerjava vseh določenih MK v ekstraktih trosnjakov je prikazana na sliki 4-3. Iz rezultatov v tabeli 7-6 (priloga 6) je razvidno, da so v vseh ekstraktih prevladovale palmitinska (C16:0), arahidinska (C20:0), oleinska (C18:1-9) in linolna (C18:2-6) MK, kar je tudi v skladu z literaturo. Iz vseh ekstraktov smo pri CE s heksanom dobili najvišje deleţe 22,4 % nasičene palmitinske (C16:0) in 38,5 % mononenasičene oleinske (C18:1-9) MK v sploščeni pološčenki (G. applanatum) ter kar 60,1 % polinenasičene linolne MK (C18:2-9) v brezovi odpadljivki (P. betulinus). Najvišji skupni deleţ SFA ima S. hirsutum (49 %), MUFA ima G. applanatum (45,1 %) in PUFA ima P. betulinus (60,9 %). 3 Retenzijski čas je čas, ki preteče od trenutka injiciranja zmesi do detekcije pika. 29

44 Delež *%+ Ekstrakcija biološko aktivnih spojin iz različnih vrst gob druţine Polyporaceae (luknjarke) Deleţ MK v ekstraktih C15:0 C16:0 C17:0 C18:0 C20:0 C21:0 C22:0 C23:0 C24:0 C16:1 (ω7) C16:1 (ω9) C17:1 (ω7) C18:1 (ω9) C18:1 (ω7) C20:1 C18:2 (ω6) C18:3 (ω6) C18:3 (ω3) MK Stereum hirsutum Gleophyllum odoratum Fomes fomentarius Trametes versicolor Ganoderma applanatum Fomitopsis pinicola Trametes gibbosa Trametes hirsuta Laricifomes officinalis Piptoporus betulinus Slika 4-3: Deleţ MK v ekstraktih trosnjakov Polyporaceae. 30