Abstract. Original Article

Transcription

1 Original Article Construction of a Plasmid Expressing MDA-7 Gene Modified by an ingr Sequence and Its Evaluation for Apoptosis Induction in a Hepatocellular Cancer Cell Line Ehsan Zare 1, Seyed Ebrahim Hosseini 2, Ghasem Mosayebi 3, Majid Sadeghizadeh 4, Tayebeh Hashempour 5, Seyed Younes Hosseini 6*, Behzad Khansarinejad 7** 1- M.Sc., Department of Biotechnology, School of Medicine, Arak University of Medical Sciences, Arak, Iran 2- Ph.D. Candidate, Gastroenterohepatology Research Center, Shiraz University of Medical Sciences, Shiraz, Iran 3- Professor, Department of Biotechnology, School of Medicine, Arak University of Medical Sciences, Arak, Iran 4- Professor, Department of Genetics, Faculty of Biological Sciences, Tarbiat Modares University, Tehran, Iran 5- Assistant Professor, Alborzi Clinical Microbiology Research Center, Shiraz University of Medical Sciences, Shiraz, Iran 6- Assistant Professor, Gastroenterohepatology Research Center, Shiraz University of Medical Sciences, Shiraz, Iran 7- Assistant Professor, Department of Microbiology and Immunology, Arak University of Medical Sciences, Arak, Iran *Corresponding Address: P.O.Code: , Gastroenterohepatology Research Center, Shiraz University of Medical Sciences, Shiraz, Iran Hosseinisy22@yahoo.com **Corresponding Address: P.O.Code: , Department of Microbiology and Immunology, Arak University of Medical Sciences, Arak, Iran khansarinajade@gmail.com Received: 06/Jan/2017, Accepted: 24/May/2017 Abstract Objective: Melanoma differentiation association gene-7 (MDA-7)/IL24 is a tumor suppressor gene. The ingr peptide sequence, with excellent tropism to surface integrins has been employed for targeting of therapeutic molecules toward tumor cells. The purpose of our study was to construct a plasmid expressing modified MDA-7 fused with an ingr peptide for better targeting to tumor cells. Methods: At first, we amplified the MDA-7 sequence by PCR, while the reverse primer contained the ingr peptide sequence to add it to the end of a new MDA-7 gene. The resultant MDA7-iNGR and MDA-7 were cloned into a pcdna3.1 eukaryotic expression vector. The accuracy of cloning methods, integrity of the plasmids, and sequence were sequentially evaluated by digestions, colony-pcr, and sequencing. The expressions of the plasmid constructs were assayed by ELISA following their transfection into Ad-293 cells. Next, the plasmids were transfected into Hep-G2 cells and their mrna were converted to cdna. We assessed the gene expression levels of Gadd153 and Bax. As the final step, apoptosis induction of Hep-G2 cells following transfection was evaluated by the help of PI/Annexin V staining according to flow cytometry. Results: The results showed the integrity of construct backbone in addition to reading frame of the MDA-7-iNGR sequence. A suitable expression/secretion of modified the MDA- 7.iNGR protein was detected by ELISA assay of the culture supernatant when compared to the control construct that expressed unmodified MDA-7. The viabilty test demonstrated no benefit for this kind of modification of the MDA-7 protein. Real-time PCR and flow cytometry analyses revealed that the addition of ingr to MDA-7 caused a decrease in its apoptotic effect on hepatic tumor cells compared to the normal protein. The modified protein had significant apoptosis induction compared to the negative control group (P<0.01). Conclusion:Although the new pcdna/mda-7.ingr plasmid expressed ingr-fused MDA- 7 protein efficiently, it could not improve the natural apoptosis property of normal MDA-7. Keywords: MDA-7, ingr peptide, Apoptosis, Tumor gene therapy Pathobiology Research, Vol. 19 ( ), No.4, Pages: Pathobiology Research, Vol. 19 ( ), No. 4 72

2 ی ب ی ب ی ب ی س مقاله اصیل ساخت سازه پالسمیدی بیانکننده شن mda-7 تغییر یافته بهوسیلۀ توالی ingr و ارزیابی آن برای القای مرگ سلولی برنامهریسی شده در رده سلول سرطانی کبد احسان زارع سید ابراهیم حسینی قاسم مصیبی مجید صادقی زاده **7 بهساد خوانساری نژاد 4 5 طیبه هاشم پور سید 1- کبرضنبس ارضذ بخص بیوتکنولوصی پشضکی دانطکذه پشضکی دانطگبه علوم پشضکی اراک اراک ایزان 2- دانطجوی دکتزی تخصصی مزکش تحقیقبت کبذ و گوارش دانطگبه علوم پشضکی ضیزاس ضیزاس ایزان 3- استبد بخص بیوتکنولوصی پشضکی دانطکذه پشضکی دانطگبه علوم پشضکی اراک اراک ایزان 4- استبد بخص صنتیک دانطکذه علوم سیس ی ت دانطگبه تزبیت مذرس تهزان ایزان 5- استبدیبر مزکش تحقیقبت عفونی استبد البزسی دانطگبه علوم پشضکی ضیزاس ضیزاس ایزان 6- استبدیبر مزکش تحقیقبت کبذ و گوارش دانطگبه علوم پشضکی ضیزاس ضیزاس ایزان 5- استبدیبر بخص میکزوة ضنبسی دانطکذه پشضکی دانطگبه علوم پشضکی اراک اراک ایزان *آدرس نویسنذه مسئول: ایزان ضیزاس کذپستی: دانطگبه علوم پشضکی ضیزاس مزکش تحقیقبت کبذ و گوارش Hosseinisy22@yahoo.com *6 یونس حسینی **آدرس نویسنذه مسئول: ایزان اراک کذپستی: دانطگبه علوم پشضکی اراک دانطکذه پشضکی بخص میکزوة ضنبسی khansarinajade@gmail.com چكيده دریبفت مقبله: 94/11/16 پذیزش مقبله: 96/13/13 هدف: طى mda-7/il-24 یک طى ػشک ةگش س ه س اػز. دذشیذ ingr ثب گشایؾ ث ای شگشیي ابی ػاغ ػال ذفو ذػبصی ػ اهل دسهب ی ػلی ػل هشلل ث دذشیذ ingr هقبیؼ فؼبلیز آى ثب طى عجیؼی اػز. مواد و روشها: س الی دس ا ش بی ػاشعب ی دس س ه سی ث کبس گشفش ؿذ اػاز. اذا ایاي هغبلؼا ػاب ز طى mda-7/il-24 دس اثشذا mda-7 ثب اػشفبد اص س ؽ PCR سکثیش یبفز. آغبصگش ثشگز حب ی س الی دذشیذ ingr ث د ساب ایاي طى mda-7 ایدبد ؿ د. سا الی طى سغییاش یبفشا mda7 mda7/ingr )ک شاش دس بلال ثیاب ی pcdna3.1 د دهبىػبصی ؿذ ذ. ثب اػشفبد اص س ؽ یکذبسچگی بلل ب س الی آى ب اسصیب یث ضن آ ضیوی colony-pcr س الییب یث ؿذ. ثب اػشفبد اص لیذ فکشبهیي ػابص اب دس ػال آى ب ثشای ثیبى دش سئیي سشکیت ثب اػشفبد اص آصهابیؾ االیاضا اسصیاب یث سشا ؼفکز ثؼذ اص اػشخشاج mrna ثب اػشفبد اص س ؽ Real time PCR ا ذاص گیشی ؿذ. ثب س گآهیضی ی کابسی دسػاشی د دهابىػابصی ابی Ad-293 سشا ؼافکز س ا ابیی ؿاذ. دس اداها ایاي ػابص اب ثا ػال ابی HepG2 ثیبى طى Anexin/PI فل ػیش هششی هیضاى هشگ ثش به سیضی ؿذ دس ػل نتایج: شبیح دسػشی یکذبسچگی ػبص ب سا بى داد. ثیبى ه بػت سشؿ هحل دایؾ آد دشا صی Bax Gadd153 HepG2 اسصیب یث ؿذ. ثب ک شش آى یؼ ایmda-7 mda-7. ingr دس ػ ح س یی لبثل هقبیؼ ث د. شبیح ص ذ هب ی بىگش ػذم هفیذ ث دى ایي سغییاش ثاش داش سئیي mda-7 ثا د اػاز. ثشسػای هشگ ػل لی ثش به سیضی ؿذ ثب ػا دؾ ثیابى طى فل ػایش هششی یاض ابى داد کا اسلاب ingr ثا mda-7 ثاش بكایز هشگصایی آى سأثیش کب ذ داؿش لی دس هقبیؼ ثب گش ک شش ه فی وچ بى هشگصایی هؼ یداسی داسد )0/01<P. نتيجهگيری: بلل ثیب ی بكیز هشگصایی عجیؼی دش سئیي pcdna/mda-7.ingr سأثیش ث ی ای ذاؿز. دش سئیي mda-7 هشلل ث ingr سا ثا عا س ه بػات ثیابى کاشد لای ثاش کليدواشگان: mda-7 ingr هشگ ػل لی طى دسهب ی س ه س 28 پژوهشهایآسیبشناسیزیستی دوره 91 شماره 4 زمستان 9315 صفحات: پژوهشهای آسیبشناسیزیستی دوره 91 شماره 4 زمستان

3 مقدمه melanoma differentiation associated ( mda-7 Interleukin 24: IL-24( 24 ای ششلااا کیي یاااب gene-7 IL-( Cytokines )10 10 ػایش کیي ابی ب اد اص ػض ی ثاب 1995 ػاب دس ثبس خؼشیي IL-26 IL-22 IL ابی ػل دس افششالی Hybridization( د سگ ػبصی س ؽ ثبفاز ابی دس ثیشش IL-24/mda-7 ]1[. ؿذ کف هال هبیی ویيعا س ه ػیز ب دس ل ف ث ایو ی ػیؼشن ثب هشسجظ خبیگاب هایؿا د. ثیابى Keratinocytes( کشاسی ػایز اب دش سئی ای شبس بی فشاػاب دش سئی ای سا الی هبث ز ط هی اب اد ػیش کیي بی ثب هقبیؼ دس آى ثیب ی الگ بی ث ػال ایاي ؿاذ 24 ای ششلا کیي ث mda-7 بم سغییش ث ه دش IL-10 IL-10 ػایش کیي ابی اب اد اص خذیاذی ػض ث ػ اى طى 2[. ]1 ؿذ هؼشفی یاب ثیاب ی بلال اص اػاشفبد ثب mda-7/il-24 ثیبى افضایؾ ؿاذ ثش به سیاضی هشگ سؿذ ه بس ثبػث سشکیت یش ع د ػاز خول اص هخشلف س ه سی بی ػل Apoptosis( سحان هشکاضی ػلاجی ػیؼشن ػی Prostate( دش ػشبر ]3[. هیؿ د سی Colorectal( ثضسگ س د خول اص ػل لی دیبهجش بی ه لک دیبمسػب ی هؼیش بی RNA ثا اثؼاش R کی ابص داش سئیي Caspases( کبػذبص ب ثاب ؿا ذ فؼاب کی بص دش سئیي Protein Kinase :R PKR( Mitogen-activated protein kinases: MAPK( هیشا طى ingr ژنmda-7 تغییریافتهبوسیلهتوالی سازهپالسمیدیبیانکننده سا الی افاض دى 5[. ]4 ؿا د ػیش کیي اب اص اػشفبد ثب دسهب ی ساأثیش ابىگاش یاش ا هغبلؼ دس حبضش هحققبى س ػظ RGD ثا د mda-7 داش سئیي هاشگصایای هیاضاى دس س الی ایي هثجز هفیاذ ػاذم اص سا دیگاشی شابیح اهب دیشش هغبلؼبر ]6[. اػز دذشیاذ ثاب وا الجش ک اػز داد بى دذشیذ ثب ذفو ذی ث دى س ها س ػاش ت ثا ingr دذشیذ 8[. ]7 اػز ؿذ ا دبم RGD Integrins( ای شگشیي بی هشلال س ها س هخلا ف یظ اسد RGD دذشیاذ بی ثا ؼاجز ثیاششی هیضاى ث هیؿ د ایاي دس س ها س ث ؿ ذ هشلل س الی هیؿ د. س ه سی ثبفز Asn_Gly_Arg( NGR سا الی خذیاذ دذشیاذ ثا کا اػاز س ها س سؿاذ دس دسگیاش آ اضین یاک ک ا ذ سلیبلی CD13 افاض دى کا فاشم ایاي ثب ]9[. هیؿ د هشلل اػز سگصایی افشاشات دس mda-7 طى ثا ingr دذشیذی د جبل سهضگزاس س الی ثا طى هحلا س د هؼوا لی احی اص س ه سی احی ثا آى ذفو اذی ث ج د ثبػث ث د ا ذ هؤثش س ه س ثبفز ثیاب ی ػابص س لیاذ عشاحای هایؿا د س ها سی ا احی ؿاذ ا دابم ingr ثا هشلال mda-7 داش سئیي س لیذک اذ دس ؿذ. ثشسػی ػبص ایي س ػظ سشکیت دش سئیي ثیبى لبثلیز ػاشعب ی ػال ػاشک ة دس یبفش سغییش طى کبسآهذی بیز چ یي ؿذ. هقبیؼ سغییش فبلذ طى ػولکشد کبسآهذی ثب HepG2 ثشسػای ثا کا ثخایذ ا اذ سا اهکبى ایي هب ث هحل لی ساي دس ى ساي ثاش ى دس یبفشا سغییاش داش سئیي ایاي ثیاشش ثذشداصین. phosphatidylinositol-3-( ای صیشا فؼفبسیذیل کی بص 3 روشها و مواد انجام PCR شن دودمانسازی و Mda-7 دس ثا کابس هغ هحققیي اص هبدس mda-7 ثیب ی دالػویذ Dr. ( کاشیغ اػشیفب ی دکشش ب ن اص ] ذی ؿذ س ی صهی ایي اؿابس آى ثا دیگاشی هقبلا دس لجال ک ] Stephanie Kreis Miniprep( داشح هی ای هقیابع دس دالػویذ ]7[. اػز ؿذ Endoplasmic [ ا ذ دالػااوی ؿااجک اػااششع kinases دس mda-7/il-24 ثیابى ثا د جاب ]stress ER( Reticulum ثش بها سیاضی هاشگ القابی ثب هیؿ ذ فؼب ػشعب ی ػل ]1[. هیؿ ذ س ه س ػشک ة ثبػث ػل لی ؿذ RGD هثاااال هخلاااای دذشیااااذ بی اص اػااااشفبد NGR Arg-Gly Asp( Arginylglycylaspartic acid( طى ث ج د ػجت هیس ا ذ هخشلف اؿکب دس CRNGRGPDC( 29 Pathobiology Research, Vol. 19 ( ), N

4 مهدیدوستداروهمکاران ایاي هشاحال سوابهی اػاز رکاش ث الصم ؿذ. اػشخشاج س ی ط اػشخشاج کیز ثب یبفش سکثیش ػاذغ ؿاذ ذ. بلقػابصی 92- کاذ ثب دضؿکی دظ ؾ بی دس الت ا کویش دس دظ ؾ ؿااذ ضاان بلاال دس ؿااذ اابلق mda-7.ingr لغؼاا ؿذ. سل یت T4 DNA آ اضین اص اػاشفبد ثاب pcdna 3.1 یبفشا سخلیق اص دلیواش ص دیاش ای اکا ؾ ثاب mda-7 سا الی اثشاذا دس لیشا ا ی Fermentase( ؿذ الحبت لیگبص اص اب گشم 200 آغابصگش ؿاذ. سکثیاش اؿشیایب هیضثابى ثابکششی دس ؿیویبیی س ؽ ثب الحبت هحل Polymerase chain reaction: PCR( کا ثا د ingr دذشیذ کذک ذ س الی حب ی ثشگز سشا ؼف سم DH5α ػ ی Escherichia coli: E. coli( کلی Primer( ثاب PCR ؿذ. عشاحی طى ا ش بی دس س الی ایي ز ػب ث ه ظ س ؿذ ذ. 1 )خذ ثشگز سفز آغبصگش س الی بی اص اػشفبد 30 ثب حاب ی ا شخابثی هحیظ س ی ؿذ سشا ؼف سم بی ثبکششی 2 )خذ صهب ی ثش به هغبثق چش ػاذغ گشفاز. ا دابم Ampicillin( ػیلیي آهذی آ شیثی سیک ػاذغ ؿاذ ذ. غشثاب ؿذ سحلیل دسكذ 1 الکشش ف سص ط ث ػیل PCR هحل ثا كا سر کلا ی اب اص سؼاذادی د دهابىػابصی سأییذ ثشای PCR هحل آى دی دس هحلا ػاذغ ؿاذ. بلقػبصی اص اػاشفبد ثاب PCR الگا ی ث ػ اى ؿذ ذ ا شخبة سلبدفی colony-pcr( ثشگز سفز آغبصگش بی ؿذ ذ. ثشسػی آ ااضین اابی ثااب pcdna3.1 بلاال ؿااذ سخلاایق PCR سا الییابثی ثاب بلل ب یکذبسچگی د دهبىػبصی دسػشی ؿاااذ ذ آ ضیوااای ضااان XhoI EcoRV هحذ دک اااذ 1 )خذ سفز آغبصگش بی اص اػشفبد ثب بلل ؿاذ. ثشسػای لغؼ بلل آ ضیوی ضن هحل. لیش ا ی Fermentase( mda-7.ingr mda-7 سکثیش ثشای ثشگز سفز آغبصگش بی س الی 1 جدول 5 -CCCCCGATATCGCCATGAATTTTCAACAGAG-3 **5 AAACTCGAGTCAGCCGCTGCCGCCGAGCTTGTAGAATTTCTGCATC-3 ***5 AAACTCGAGTCAGCAGTCGGGGCCCCGGCCGTTCCGGCAGCCGCTG CCGCCGAGCTTGTAGAATTTCTGCATC-3 Mda-7/iNGR Mda-7 سفز آغبصگش س الی Mda-7 ثشگز آغبصگش س الی Mda-7/iNGR ثشگز آغبصگش س الی اػز. EcoR V هحذ دگش آ ضین ثشؽ خبیگب صیشیي ظ ثب ؿذ هخق *س الی هحذ دگش آ ضین ثشؽ خبیگب صیشیي ظ ثب ؿذ هخق **س الی اػز. Xho I Xho I هحذ دگش آ ضین ثشؽ خبیگب دی ػش صیشیي ظ ثب ؿذ هخق ***س الی اػز. ingr دذشیذ کذک ذ ه قغغ صیشیي ظ ثب ؿذ هخق س الی mda-7.ingr mda-7 لغؼبر سکثیش ثشای PCR صهب ی ثش به 2 جدول تكرار تعداد زمان دما سانتیگراد( )درجه مرحله ا لی اػشؿشگی Primary Denaturation( 95 دلیق 5 1 اػشؿشگی 95 ثب ی 30 Annealing( اسلب 58 ثب ی Extension( ثؼظ 72 ثب ی 50 Final Extension( بیی ثؼظ 72 دلیق آسیبشناسیزیستی دوره 91 شماره 4 رمستان 9315 پژوهشهای 03

5 ی ب ترانسفكطن و سلولی کطت ingr ژنmda-7 تغییریافتهبوسیلهتوالی سازهپالسمیدیبیانکننده سلول مانی زنده آزمون Enzyme-Linked Immunosorbent ( االیوسا آزموون )assay: ELIZA بلل بی سشا ؼفکي بیAd-293 ػل کز اص ثؼذ pcdna3.1/mda-7.ingr pcdna3.1/mda-7 ه فی )ک شش pcdna اص داغ اب ػل س یی هحیظ 5 ثا هاذر دلیق دس 5000 د س ثب ؿذ ذ خوغآ سی ػبػز س یای هابیغ دس mda-7 غلظز ػذغ ؿذ ذ. ػب ششیف ط دلیق ػل آهشیکب هشحذ ایبالر ebioscience Inc.( ا ؼب ی 24 عجاق ثا عا س ثبس ػ آصهبیؾ ایي ؿذ. ا دبم ؿذ اسای دػش سالؼول گشفز. ا دبم هؼشقل تكنيک Real-Time PCR س ؽ اص اػاشفبد ثاب Bax GADD153 ثیبى real-time ػل سشا ؼفکي اص دغ ػبػز 48 PCR شیک ثب HepG2 بی الكاا ثاا عاا س گشفااز. ا داابم pcdna3.1 7.iNGR RNA اػااشخشاج هحلا اص اػااشفبد ثاب ػاال سابم RNA ایشاى )ػی بطى ؿذ اػشخشاج TRIzol هؼکا ع س یؼای اص دغ گشفز. ا دبم )آهشیکب Invitrogen کیز اص اػشفبد ثب ثیابى ؿاذ اػاشخشاج RNA و ا ابی اص cdna ز ػاب طى ثاا ػ اا اى PGK GADD153 Bax طى اابی mrna اص اػاشفبد ثاب ک شاش لا هذا گاش د دس لای دا ک شاش آغبصگش کوک ثب سک یک خذ دبػاااش س ا ؼاااشیش اص HepG2 Ad-293 ػااال لی سد Dulbecco's ( DMEM هحااایظ دس ؿاااذ شیاااذاسی 10 گ ػابل ػشم ثب ؿذ غ ی Modified Eagle's Medium ثشسػای ثا ه ظا س Ad-293 ػال ؿاذ. داد کاز دسكاذ دیگاش عاشا اص ؿاذ. اػشفبد سشکیت ػبص بی ثیبى لبثلیز mda-7/il-24 mda-7 طى ابی هشگصایای اثش هقبیؼ ثشای ثا کابس اػز کجذی ػشعب ی سد یک ک HepG2 ػل لی سد ؿؾ سب ػ آصهبیؾ ایي دس اػشفبد ه سد بی ػل گشفش ؿذ. دس ى ثا بلال اب وا دى سشا ؼفکز ثشای ؿذ ذ. داد دبػبط Lipofectamine )2000 لیذ فکشابهیي هحل اص ػل ؿاشکز دػاش سالؼول هغابثق آهشیکاب Invitrogen Inc( pc/mda- pc/mda-7 بلل ابی ک بس دس ؿذ. ػول ػبص ذ CAG-GFP دالػاویذ وچ ایي طى ثاذ ى بلل اص 7.iNGR ؿذ. اػشفبد سشا ؼفکي ک شش ثشسػی ث ه ظ س 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-Yl)-[ MTT آصهاااااا ى اص ثشسػاااای ثااااشای ]2,5-Diphenyltetrazolium Bromide ؿاذ. اػاشفبد HepG2 Ad-293 ابی ػل صیؼز لبثلیز سؿذ ب 96 دلیز چب ک ش دس ػل ث ع سهؼو pcdna3.1/mda- سشا ؼفکاي ػبػز 24 اص ثؼذ ؿذ. داد ؿااذ. ا داابم pcdna3.1 7, pcdna3.1/mda-7.ingr دسكاذ )0/5 MTT هحلا هیکش لیشش 20 ػبػز 24 اص دغ هیکش لیشاش 150 ؿاذ. ا ک ثا ػبػز 4 ؿذ افض د هحیظ ث چب ااک ااش ثا Dimethyl sulfoxide( DMSO هحلا ک اذ. حال سا Formazan( ف سهابصاى هحل سب ؿذ اضبف ثااب ااب هشش هاا ج 570 عاا دس س گاای هحلاا خاازة ا دابم ثابس ػا آصهبیؾ ب کل ؿذ. ا ذاص گیشی اػذکشش فش هشش ؿذ. IL- ػا دؾ االیاضای کیاز اص اػشفبد ثب Ad-293 بی pcdna3.1/mda- pcdna3.1/mda-7 ػااابص ااابی اص Real- ؿاذ. ػا دؾ 3 Maxima SYBR Green( ؿاااذ ػااا دؾ Time PCR فشها اص اػاشفبد ثاب ؼاجی ثیابى. لیشا ا ی Fermentase( 2 ΔΔCt اص آهابسی سحلیال ثاشای هغبلؼا ایاي دس ؿاذ. ا دبم شابیح ؿاذ. اػاشفبد Graf pad prims Exel اشمافضاس ابی آصها ى اص اػاشفبد ثب Real-Time PCR آصه ى بی اص حبكل هقبیؼا ثاب Analysis of variance( ANOVA آهابسی 31 Pathobiology Research, Vol. 19 ( ), N

6 مهدیدوستداروهمکاران ؿذ. سحلیل داد ب هیب گیي ضده برنامهریسی سلولی مرگ سنجص کیاز اص اػاشفبد ثب ؿذ ثش به سیضی ػل لی هشگ ػ دؾ س اگآهیااضی ثاشای Annexin V Apoptosis Detection ػل گشفاز. ا دبم pcdna3.1 pcdna3.1/mda-7 ingr ػل Phosphate-buffered saline( PBS ثاب ثبس یک ب اسلاب ثابفش ثاب ثبس یک ػذغ Binding Buffer( 1x ؿؼاش اب ػل اص هیلیلیشش دس بیی غلظز ث ػذغ ؿذ ذ. اسلب ثبفش V آ کؼایي اص هیکش لیشاش 5 اداه دس ؿذ. افض د 1x ( فلاا س کش م ثااب ک ظگاا Fluorochrome-conjugated annexin v اضابف ػل لی ػ ػذب ؼی ى اص هیکش لیشش 100 ث ػاذغ ؿاذ ذ ا ک ثا اسابت دهبی دس دلیق 10 ث هذر ؿذ. ػل اسلب اسلب ثبفش ثب ب ثبفش اص هیکش لیشش 200 ؿذ ذ ؿؼش 1x س گآهیضی هحل اص هیکش لیشش 5 ؿذ. اضبف آى ث 1x Propidium iodide( یذیذ دش دیذی م 30 اص ثؼاذ ؿذ. اضبف اص اػاشفبد ثاب ػاب شیگاشاد دسخ 4 دهبی دس گ ذاسی دلیق ػل فل ػیش هششی سحلیل ؿذ ذ. ؿوبسؽ ؿذ س گآهیضی بی گشفز. ا دبم Flowjo شمافضاس اص اػشفبد ثب داد ب بیی PGK Bax GADD153 سکثیش ثشای ثشگز سفز آغبصگش بی س الی 3 جدول )5' 3'( توالی GCCCTTTTGCTTCAGGGTTTCA CAGCTTCTTGGTGGACGCAT CACCTCCTGGAAATGAAGAGGAAG GAGGTGCTTGTGACCTCTGC TAAAGCCGAGCCAGCCAAAA CTCCTACCATGGAGCTGTGG BAX F1 BAX R1 GADD153 F GADD153 R PGK1 F1 PGK R1 حاذ د ث سشسیات )ک شش pcdna3.1 بلی بلل 7.iNGR نتایج pcdna3.1/mda-7- ثاب ؿذ سشا ؼفکز HepG2 بی Mda- سا الی ثیابى ثشای ثیب ی بلل ث ػ اى pcdna3.1 ضان اص دغ ؿذ. ا شخبة ی کبسی ر بی ػل دس 7.iNGR Mda- Mda-7 ؿاذ سخلیق یبفش سکثیش لغؼبر آ ضیوی د دهبىػابصی pcdna3.1 ؿذ ضن ثیب ی بلل دس 7.iNGR )ؿکل ؿذ ا دبم Colony-PCR وؼبىػبصی سأییذ ثشای ؿذ. ثاب بلال اب یکذابسچگی د دهبىػبصی دسػشی وچ یي )ؿکل ؿذ سأییذ بلل س الییبثی ابى MTT آصه ى اص اػشفبد ثب هب ی ص ذ ثشسػی شبیح 24 سشا ؼفکاي اص دغ 293 بی ػل دس هشگ هیضاى ک داد دالػاویذ گاش ثاب هقبیؼ دس سشکیت دالػویذ بی ثب ػبػش هیضاى. )0/05<P داس ذ سفب ر یکذیگش ثب آهبسی لحبػ اص بلی سشکیت بلل بی ثب ؿذ سشا ؼفکز بی ػل دس هیش هشگ. 3 )ؿکل ؿذ اسصیبثی دسكذ 11 دسكذ دسكذ Mda-7 pcdna3.1 بلاااال اااابی pcdna3.1 ثاب یض ثیبى هیضاى ثشسػی ث ه ظ س pcdna3.1 Mda-7.iNGR ػل ث لیذ فکشبهیي اص اػشفبد 48 اص ثؼذ ػل س یی هبیغ ػبػز ؿذ ذ. سشا ؼفکز Ad-293 بی االیضای س ؽ ثب ثشداؿز ب mda-7 ثیبى بىد ذ ELIZA شبیح ؿذ ذ. ثشسػی شلبكی ا بلال ابی س ػاظ ث سشسیت ب گشم/هیلیلیشش 7 8 هقبدیش دس pcdna3.1 Mda- pcdna3.1 Mda-7 pcdna3.1 pcdna3.1- pcdna3.1-mda-7-ingr سشکیاااااات ک شاش گاش ابی ػل ثیبى ثب هقبیؼ دس ک ث د ذ Mda-7 pcdna3.1 ثاااب ؿاااذ )سشا ؼااافکز 0/5 اص -کوشااااش آهبسی ثشسػی آصهبیؾ سکشاس ث د. ثیشش ثؼیبس ب گشم/هیلیلیشش 32 آسیبشناسیزیستی دوره 91 شماره 4 رمستان 9315 پژوهشهای 08

7 اص شیاک ثاب ؿاذ القاب ثیبى سفب ر ث دى هؼ یداس ک ذ سأییذ mda-7 طى فبلذ ثیب ی بلل ث ؼجز سشکیت ثیب ی بلل بی یبفش سغییش طى حب ی سشکیت بلل ثب ؿذ القب ثیبى عشفی اص ث د. ingr ژنmda-7 تغییریافتهبوسیلهتوالی سازهپالسمیدیبیانکننده Mda-7.iNGR mda-7 سغییش ثذ ى طى حب ی سشکیت بلل ثب ؿذ القب ثیبى ثب. 4 )ؿکل ویداد بى هؼ یداسی سفب ر ابی ػال دس ػال لی هشگ القبگش طى بی ثیبى ثشسػی pcdna3.1/mda-7 ػبص ابی اص شیک ثب ؿذ سشا ؼفکز کاا داد اابى pcdna3.1 pcdna3.1/mda-7.ingr pcdna3.1/mda- pcdna3.1/mda-7 ػااابص ااابی القابگش طى ابی ثیابى افضایؾ ه خت ه د ث ع س 7.iNGR HepG2 ػااشعب ی سد دس Bax Gadd153 ػاال لی هااشگ ثش سأثیشی pcdna3.1 ػبص هیس د ا شظبس چ ب چ هیؿ ذ دس Bax Gadd153 ػاال لی هااشگ القاابگش طى اابی ثیاابى ػل آصهبیؾ سکشاس. 5 )ؿکل ذاسد HepG2 ػشعب ی بی طى بی ثیبى افضایؾ ک داؿز آى اص بى شبیح آهبسی سحلیل ػبص بی القبی اص بؿی Bax Gadd153 ػل لی هشگ القبگش ػابص اص حباكال القابی ث ؼجز هؼ یداسی ع س ث سشکیت طى ابی ثیابى افضایؾ خ د ایي ثب داسد سفب ر pcdna3.1 ػبص بی القبی اص بؿی Bax Gadd153 ػل لی هشگ القبگش ثااااااب pcdna3.1/mda-7.ingr pcdna3.1/mda-7 وید ذ. بى هؼ یداسی سفب ر یکذیگش سأییاذ دس یض ؿذ ثش به سیضی ػل لی هشگ ػ دؾ شبیح کا اػاز آى د اذ بى ػل لی هشگ القبگش طى بی القبی هاشگ mda-7.ingr mda-7 طى ابی ه لاز ثیبى افضایؾ ػال ؿاذ ثش به سیضی ثا عا س سا HepG2 ػاشعب ی ابی ثش به سیضی ػل لی هشگ القبی لی هید ذ افضایؾ هؼ یداسی بى هؼ یداسی سفب ر آى ب اص شیک س ػظ ؿذ ایدبد ؿذ. 6 )ؿکل وید ذ ضكل سشا ؼف سم ثبص خفز )660 Mda-7.iNGR سشکیت لغؼبر خ د ثشسػی ثشای colony-pcr 1 )چخ ثبص خفز )621 Mda-7 )ساػز ؿذ. ا دبم آهذیػیلیي حب ی ا شخبثی هحیظ ثب ؿذ غشثب pcdna3.1-mda-7 pcdna3.1-mda-7.ingr سشکیت بلل بی اص حبكال کلا ی ابی دس 33 Pathobiology Research, Vol. 19 ( ), N

8 ػل هب ذگی ص ذ دسكذ مهدیدوستداروهمکاران ضكل كحی چ بسچ ة حفؼ ثیب ی بلل س الی ثب دی ػشگی دس ا ؾ Mda-7.iNGR س الی سأییذ س ص pcdna3.1 pcdna3.1/mda-7 pcdna3.1/mda-7.ingr ػل هب ی ص ذ ثشسػی 3 ضكل MTT آصه ى اص اػشفبد ثب س ص ؿؾ صهب ی ثبص دس pcdna3.1/mda-7 pcdna3.1/mda-7.ingr ثب ؿذ سشا ؼفکز HepG2 بی 34 آسیبشناسیزیستی دوره 91 شماره 4 رمستان 9315 پژوهشهای 03

9 ingr ژنmda-7 تغییریافتهبوسیلهتوالی سازهپالسمیدیبیانکننده ضكل ثبالی اػذاد.Mda-7 دش سئیي ػلی ELIZA شلبكی ا آصهبیؾ ا دبم ثب.pCDNA3.1/Mda-7 pcdna3.1/mda-7.ingr سشکیت بلل بی ثیبى ثشسػی 4 ػل س یی ػ ح دس سا دیک گشم/هیلیلیشش حؼت ثش mda-7 دش سئیي غلظز هیب گیي ػش ى ش بی pc/mda- سشکیت بلل بی اص شیک ثب ؿذ سشا ؼفکز Ad-293 ػا هؼیابس ا حاشاا هؼاشا ػاش ى اش ثبالی دس غب اس اػز. ؿذ اػشفبد آصهبیؾ ک شش ث ػ اى pcdna3.1 بلی بلل هید ذ. بى pc/mda-7 7.iNGR هید ذ. بى ن ثب هقبیؼ دس سا گش د سفب ر ث دى هؼ یداس ػشبس ػالهز اػز. اثؼش غیش آصهبیؾ ضكل ک شاش ثا ؼجز Mda-7.iNGR Mda-7 حب ی ثیب ی بلل بی ثب ؿذ سشا ؼفکز HepG2 ػشعب ی سد بی دس Bax GADD153 ثیبى افضایؾ هقبیؼ 5 ػل دس طى ]ثیبى آصهبیؾ ا حشاا هؼشا ػش ى ش ثبالی دس غب اس اػز هؼشقل آصهبیؾ ػ هیب گیي ػش ى ش [. pc( pcdna 3.1 بلل ثب ؿذ سشا ؼفکز بی هید ذ. بى ن ثب هقبیؼ دس سا گش د سفب ر ث دى هؼ یداس ػشبس ػالهز اػز. اثؼش غیش آصهبیؾ ػ هؼیبس 35 Pathobiology Research, Vol. 19 ( ), N

10 مهدیدوستداروهمکاران الف- pcdna 3.1 بلل ثب ؿذ سشا ؼفکز ک شش گش الف- 1 دالػویذ ب ا شقب ث د جب HepG2 ػشعب ی بی ػل ؿذ ثش به سیضی هشگ ػ دؾ )الف( 6 ؿکل ثش به سیاضی هشگ ثب بی ػل دسكذ Q2+Q3 بحی.Mda-7.iRGD ثیب ی دالػویذ ثب سشا ؼفکز گش الف- 3 Mda-7 ثیب ی ثبدالػویذ ؿذ سشا ؼفکز گش 2 ثیاب ی ػابص ابی ثاب ؿاذ سشا ؼافکز گاش ابی دس سا ػال لی ؿذ ثش به سیضی هشگ ثب س ه سی بی ػل دسكذ هیب گیي هقبیؼ )ب( هید ذ. بى سا ػل لی ؿذ ا حاشاا هؼشا ػش ى ش ثبالی دس غب اس اػز هؼشقل آصهبیؾ ػ هیب گیي ػش ى ش هید ذ. بى pcdna3.1 ک شش بلل pc/mda-7.ingr pc/mda-7 هید ذ بى ن ثب هقبیؼ دس سا گش د سفب ر ث دى هؼ یداس ػشبس ػالهز اػز. اثؼش غیش آصهبیؾ ػ هؼیبس 36 آسیبشناسیزیستی دوره 91 شماره 4 رمستان 9315 پژوهشهای 03

11 بحث ه بس س ا بیی ثب mda-7/il-24 طى-دش سئیي حبضش حب دس شلبكای ا ؿاذ ثش بها سیاضی ػال لی هاشگ القابی سؿذ ػل دادى بى س ه س ػلی ایو ی دبػخ افضایؾ ػشعب ی بی دسهب ی ؿیوی دسهبى بی سق یز سگصایی ضذ ل كیبر دسهبى دس س ه س ػشک ةگش طى-دش سئیي یک ث ػ اى ػشعبى 12-10[. ]2 اػز س خ ه سد ثؼیبس ػشعبى یذ خذیذ دػشب سدی ػشعبى دسهبى دس دذشیذ ب اص اػشفبد اذایز اسلاب ثاشای دذشیاذ ب بسگیشی ثا کا اػاز. ثخاؾ ذاگیشی ثب هیس ا ذ س ه س خبیگب ث دسهبىگش دش سئیي بی 15-13[. ]5 ک ذ کوک س ه س ػشک ة ث دسهبىگش دش سئیي ث شش ػاوز ثا سا داس هیس ا اذ RGD NGR وب ذ دذشیذ بیی Lei( لی د ذ. افضایؾ سا دسهبى کبسآیی د ذ ػ ت س ه س ingr ژنmda-7 تغییریافتهبوسیلهتوالی سازهپالسمیدیبیانکننده کشد ذ اػشفبد سغییشیبفش کیل دالش ی 15 اکشیي یک اص وکبسا ؾ ػش ت یب س ه س اسد یض آى هیؿذ هشلل NGR دذشیذ ث ک دذشیذ ایي ک ؿذ هخق سحقیق ایي دس ]15[. هیؿذ س ه سی ػولکاشد س ی ثاش اثاش ػل لی داسثؼز ث اسلب ثب هیس ا ذ HepG2 ابی ػل ؿذ ثش به سیضی هشگ ػل لی داسثؼز ثاب وکبسا ؾ Pei( دی دیگش هغبلؼ دس ک ذ. القب سا HeLa آسط ایي آهی بی اػیذ هبثیي گالیؼیي آهی اػیذ خبیگضی ی کاف آى دس RGD ایدابد IL-24 س الی دس گل سبهیک اػیذ ؿاذ ثش بها سیاضی هاشگ القاب ػولکاشد سغییش ایي ک کشد ذ ػل ثاب هید ذ افضایؾ سا RGD-IL-24 س ػظ س ه سی بی ػال ثش آى ػولکشد ػذم ثش خ د ایي ساأثیشی عجیؼای ابی هغبلؼ چ ذ دس mda-7 دش سیي ه سد دس اهش ایي ]16[. ویگزاسد 16[. 6 ]5 ؿذ ایدبد ه بػجی شبیح ؿذ ثشسػی دیگش ػل ث سػیذى ثشای ػل س ه سی بی دبسا یوی بی اسد ک اذ ػج س ػش لی ػذ اص ثبیذ داس ب س ه س ثب هشسیظ ثا دسهبىگاش دش سئیي بی ذفو ذػبصی ؿ ذ. س ه سی ثؼشش RGD ingr هثل ذاگیشی دذشیذ بی کوک ثب س ه س ثؼشش آثابس اثدابد س ها سی خبیگب دس دش سئیي سغلیؼ ث هیس ا ذ ]13[. وبیذ کوک ه ضغ ایي دس ثیشش دسهب ی ثشای mda-7 طى ػولکشد ث ج د ذا ثب ک ی هغبلؼ دس pcdna3.1- ثیاب ی بلال س لیاذ عشاحی س ه س ػشک ة دس pcdna3.1 دالػااااویذ ؿااااذ. ا دااابم Mda-7.iNGR دالػویذ ایي کبسآیی اػز ؿذ اػشفبد ثؼیبسی آصهبیؾ بی ثیابىگاش شابیح اػاز. ثا د هغل ة ه سد دش ط ایي هب ذ ث خ ز دسػشی وچ یي سشکیت بلل سوبهیز س الی دسػشی دس ک داد بى حبضش ثشسػی شبیح وچ یي ث د. mda-7 طى ػل pcdna3.1-mda-7 دالػاویذ بی ک Ad-293 بی ثیاابى ث د ااذ ؿااذ سشا ؼاافکز pcdna3.1-mda-7.ingr ک شاش گاش ثا ؼاجز هالحظا ای لبثال ثا عا س mda-7 )ػل pcdna3.1 ثب ؿذ سشا ؼفکز بی ث د. یبفش افضایؾ دش سئیي ایي ا ش بی ث ingr س الی یک افض دى ای ک ه ن کش ثا سشکیات داش سئیي س لیذ هیضاى دس س خ ی لبثل سغییش یچ یاش ا سا الی کا اػز ایي ثیبىگش ه ض ع ایي ذاؿز. وشا سشکیات داش سئیي س لیذ دسػشی سشؿ ا شقب دس س ا ذ وی ک ذ. ایدبد شاللی ا بیی mda-7 هاشگصای داش سئیي ا ش بی ث ingr دذشیذی س الی ػل دس سشؿا ثیبى هیضاى ثش ػ یی سأثیش یچ HepG2 بی عجیؼی بی ػل س ی یض دش سئیي ایي وچ یي گزاؿش آى سا الی افاض دى هدو ع دس ذاسد. صایی هشگ بكیز یض 293 شبیح عجق Mda-7 هشگصای دش سئیي ا ش بی ث ingr دذشیذی بكاایز افاضایؾ ثبػاث Real-time PCR فل ػایش هششی هحایظ دس ثبیؼاشی ه ضا ع ایاي ذ. دش سئیي ایي صایی هشگ ؿ د. س ؿي هکل ایي ػلز سب ؿ د ثشسػی هدذد کبهذی سشی افض دى وی ک هید ذ بى هغبلؼ ایي الك ث ع س دسهب ی ایو ی کبس ه بػت دش سئیي یک ا ش بی دس دذشیذی س الی ثبیؼشی داسد. ثیششی ثشسػی ث یبص حشوب ج د ػیش کیي ب ثب ا اذاا ثاشای دذشیاذی سا الی افض دى وی ک داؿز ارػبى هیس ا اذ گب ی یؼز دسهبى ه بػت دش سئیي ذفو ذػبصی وایي دس ؿا د. یض آى عجیؼی ػولکشد دس شال ا ثبػث حشی ػل لی هشگ هیضاى افضایؾ ثشای دیگش دذشیذ بی اص اػشفبد ساػشب کابهذی سشی لجلای هغبلؼ ثب mda-7 س ػظ ؿذ ثش به سیضی 37 Pathobiology Research, Vol. 19 ( ), N

12 آى اص ثخای ک اػز ث د ثی سک ل طی اسؿذ هقغغ دس صاسع آى ثیاشش ثخؾ اساک دضؿکی ػل م دا گب هبلی حوبیز ثب ؿاوبس )گشا از ؿایشاص دضؿاکی ػل م دا گب حوبیز ثب یض گ اسؽ سحقیقبر هشکض دشػ ل اص اػز. گشفش ا دبم ػلا م دا اگب الجشصی دکشش ػف ی سحقیقبر هشکض یض کجذ سحقیاق آصهابیؾ ابی ا دابم دس کواک ثاشای ؿیشاص دضؿکی ػذبػگضاسین. كویوب مهدیدوستداروهمکاران هذ هایؿا د. س كی ذفو ذک ذ دذشیذ بی دیگش ثب ػبصی ثشای دش سئیي اص دیگشی قبط دس یض دذشیذ ویي اص اػشفبد الجش ث ظاش یض mda-7 ؿذ ثش به سیضی ػل لی هشگ هیضاى ثشسػی هیسػذ. ه غقی تطكر قدردانی و احؼابى آلابی دا د یی سػبل ث هشث ط حبضش سحقیق منابع [1] Lebedeva IV, Emdad L, Su ZZ, Gupta P, Sauane M, Sarkar D, Staudt MR, Liu SJ, Taher MM, Xiao R, Barral P, Lee SG, Wang D, Vozhilla N, Park ES, Chatman L, Boukerche H, Ramesh R, Inoue S, Chada S, Li R, De Pass AL, Mahasreshti PJ, Dmitriev IP, Curiel DT, Yacoub A, Grant S, Dent P, Senzer N, Nemunaitis JJ, Fisher PB. mda-7/il-24, novel anticancer cytokine: focus on bystander antitumor, radiosensitization and antiangiogenic properties and overview of the phase I clinical experience (Review). Int J Oncol 2007; 31(5): [2] Sarkar D, Su ZZ, Lebedeva IV, Sauane M, Gopalkrishnan RV, Valerie K, Dent P, Fisher PB. mda-7 (IL-24) Mediates selective apoptosis in human melanoma cells by inducing the coordinated overexpression of the GADD family of genes by means of p38 MAPK. Proc Natl Acad Sci U S A 2002; 99(15): [3] Dent P, Yacoub A, Hamed HA, Park MA, Dash R, Bhutia SK, Sarkar D, Gupta P, Emdad L, Lebedeva IV, Sauane M, Su ZZ, Rahmani M, Broaddus WC, Young HF, Lesniak M, Grant S, Curiel DT, Fisher PB. MDA-7/IL-24 as a cancer therapeutic: from bench to bedside. Anticancer Drugs 2010; 21(8): [4] Ruoslahti E. The RGD story: a personal account. Matrix Biol 2003; 22(6): [5] Xiao B, Li W, Yang J, Guo G, Mao XH, Zou QM. RGD-IL-24, a novel tumor-targeted fusion cytokine: expression, purification and functional evaluation. Mol Biotechnol 2009; 41(2): [6] Hosseini E, Hosseini SY, Hashempour T, Fattahi MR, Sadeghizadeh M. Effect of RGD coupled MDA-7/IL-24 on apoptosis induction in a hepatocellular carcinoma cell line. Mol Med Rep 2017; 15(1): [7] Khodadad M, Hosseini SY, Shenavar F, Erfani N, Bina S, Ahmadian S, Fattahi MR, Hajhosseini R. Construction of expressing vectors including melanoma differentiationassociated gene-7 (mda-7) fused with the RGD sequences for better tumor targeting. Iran J Basic Med Sci 2015; 18(8): [8] Bina S, Shenavar F, Khodadad M, Haghshenas MR, Mortazavi M, Fattahi MR, Erfani N, Hosseini SY. Impact of RGD Peptide Tethering 38 آسیبشناسیزیستی دوره 91 شماره 4 رمستان 9315 پژوهشهای 02

13 The tumor suppressor activity of MDA-7/IL-24 is mediated by intracellular protein expression in NSCLC cells. Mol Ther 2004; 9(3): [13] Assa-Munt N, Jia X, Laakkonen P, Ruoslahti E. Solution structures and integrin binding activities of an RGD peptide with two isomers. Biochemistry 2001; 40(8): [14] Dickerson EB, Akhtar N, Steinberg H, Wang ZY, Lindstrom MJ, Padilla ML, Auerbach R, Helfand SC. Enhancement of the antiangiogenic activity of interleukin-12 by peptide targeted delivery of the cytokine to alphavbeta3 integrin. Mol Cancer Res 2004; 2(12): [15] Lei H, Cao P, Miao G, Lin Z, Diao Z. Expression and functional characterization of tumor-targeted fusion protein composed of NGR peptide and 15-kDa actin fragment. Appl Biochem Biotechnol 2010; 162(4): [16] Pei DS, Yang ZX, Zhang BF, Yin XX, Li LT, Li HZ, Zheng JN. Enhanced apoptosis-inducing function of MDA-7/IL-24 RGD mutant via the increased adhesion to tumor cells. J Interferon Cytokine Res 2012; 32(2): ingr ژنmda-7 تغییریافتهبوسیلهتوالی سازهپالسمیدیبیانکننده to IL24/mda-7 (Melanoma Differentiation Associated Gene-7) on Apoptosis Induction in Hepatocellular Carcinoma Cells. Asian Pac J Cancer Prev 2015; 16(14): [9] Craig R, Cutrera J, Zhu S, Xia X, Lee YH, Li S. Administering plasmid DNA encoding tumor vessel-anchored IFN-alpha for localizing gene product within or into tumors. Mol Ther 2008; 16(5): [10] Emdad L, Lebedeva IV, Su ZZ, Gupta P, Sauane M, Dash R, Grant S, Dent P, Curiel DT, Sarkar D, Fisher PB. Historical perspective and recent insights into our understanding of the molecular and biochemical basis of the antitumor properties of mda-7/il-24. Cancer Biol Ther 2009; 8(5): [11] Nishikawa T, Ramesh R, Munshi A, Chada S, Meyn RE. Adenovirus-mediated mda-7 (IL24) gene therapy suppresses angiogenesis and sensitizes NSCLC xenograft tumors to radiation. Mol Ther 2004; 9(6): [12] Sieger KA, Mhashilkar AM, Stewart A, Sutton RB, Strube RW, Chen SY, Pataer A, Swisher SG, Grimm EA, Ramesh R, Chada S. 39 Pathobiology Research, Vol. 19 ( ), N