JUODŲJŲ SERBENTŲ SIRUPO TECHNOLOGIJOS KŪRIMAS IR KOKYBĖS VERTINIMAS

Transcription

1 LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS FARMACIJOS FAKULTETAS VAISTŲ TECHNOLOGIJOS IR SOCIALINĖS FARMACIJOS KATEDRA RAIMONDA VALANTINAITĖ JUODŲJŲ SERBENTŲ SIRUPO TECHNOLOGIJOS KŪRIMAS IR KOKYBĖS VERTINIMAS Magistro baigiamasis darbas Darbo vadovas: Doc. dr. Zenona Kalvėnienė KAUNAS, 2016

2 2 LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS FARMACIJOS FAKULTETAS VAISTŲ TECHNOLOGIJOS IR SOCIALINĖS FARMACIJOS KATEDRA TVIRTINU: Farmacijos fakulteto dekanas prof. Vitalis Briedis Data: JUODŲJŲ SERBENTŲ SIRUPO TECHNOLOGIJOS KŪRIMAS IR KOKYBĖS VERTINIMAS Magistro baigiamasis darbas Darbo vadovas Doc. Dr. Zenona Kalvėnienė Data: Recenzentas Lekt. dr. Raimondas Raudonis Darbą atliko Magistrantė Raimonda Valantinaitė Data: KAUNAS, 2016

3 3 TURINYS SANTRUMPOS... 5 SANTRAUKA... 6 SUMMARY... 8 ŢODYNĖLIS ĮVADAS DARBO TIKSLAS IR UŢDAVINIAI LITERATŪROS APŢVALGA Juodųjų serbentų (lot. Ribes nigrum L.) apibūdinimas Juodųjų serbentų (lot. Ribes nigrum L.) lapų ir uogų cheminė sudėtis Juodųjų serbentų (lot. Ribes nigrum L.) gydomosios savybės Antivirusinis aktyvumas Antimikrobinis ir priešuţdegiminis poveikis Kitas juodųjų serbentų farmakologinis aktyvumas Fenoliniai junginiai ir jų aktualumas Flavonoidai plačiai nagrinėjama fenolinių junginių grupė Sirupai Literatūros apţvalgos apibendrinimas TYRIMO METODIKA IR METODAI Darbo objektai Darbe naudotos medţiagos ir prietaisai Augalinės ţaliavos tyrimai Juodųjų serbentų lapų ekstrakto gamyba Sirupų gamyba Bendrojo fenolinių junginių kiekio nustatymas spektrofotometriniu metodu Antioksidacinio aktyvumo nustatymas 2,2-difenil-1-pikrilhidrazilo laisvojo radikalo inaktyvinimo metodu Sirupų klampos nustatymas Lūţio rodiklio nustatymas Santykinio tankio nustatymas Optinio aktyvumo tyrimas - poliarimetrija Stabilumo tyrimas Statistinė duomenų analizė REZULTATAI Ţaliavos kokybės vertinimas Nuodţiūvio nustatymas Ţaliavos dalelių smulkumo nustatymas Bendrojo fenolinių junginių kiekio nustatymas juodųjų serbentų lapuose ir uogų sausajame ekstrakte Antioksidacinio aktyvumo įvertinimas ekstraktuose Sirupų gamyba Bendrojo fenolinių junginių kiekio nustatymas sirupuose Antioksidacinių savybių nustatymas sirupuose Sirupų klampos tyrimai Lūţio rodiklio vertinimas Sirupų tankio vertinimas Optinio tankio ir cukraus koncentracijos vertinimas Sirupų stabilumo tyrimas Sirupų kokybės pokyčiai, laikant įprastomis sąlygomis (21±2 C temperatūroje)... 37

4 Sirupų kokybės pokyčiai, laikant juos klimatinėje kameroje Rezultatų aptarimas Išvados Praktinės rekomendacijos Literatūros sąrašas Priedai... 54

5 5 SANTRUMPOS AA - antioksidacinis aktyvumas DPPH - (2,2-difenil-1-pikrilhidrazil hidratas) laisvasis radikalas Ph. Eur. - Europos farmakopėja mpa*s - mili paskalis per sekundę GRE - galo rūgšties ekvivalentas EGC - epigalokatechinai EGCG - epigalokatechino galatas ECG - epikatechinas H1N1 - kiaulių gripas H7N7 - paukščių gripas IFV-AH1pdm - pandeminis m. gripas IFV-AH3 - Honkongo gripas IFV-AH1tam(r) - oseltamiviro fosfatui atsparus Rusijos gripas IFV-B - B tipo gripo virusas RSV - respiracinis sincitinis virusas COX - ciklooksigenazė LOX lipooksigenazė NO - azoto monoksidas CRE - chlorogeno rūgšties ekvivalentas

6 6 SANTRAUKA R. Valantinaitės magistro baigiamasis darbas,,juodųjų serbentų sirupo tenchnologijos kūrimas ir kokybės vertinimas / mokslinė vadovė doc. dr. Z. Kalvėnienė; Lietuvos sveikatos mokslų universiteto Farmacijos fakulteto Vaistų technolologijos ir socialinės farmacijos katedra. Kaunas. Pasaulio mokslininkų in vitro ir in vivo atliktais tyrimais įrodytas juodųjų serbentų (Ribes nigrum L.) lapų ekstrakto Ladania067 poveikis prieš gripo virusus. Ištyrus šio ekstrakto įtaką gripo H1N1 ir H7N7 virusams, nustatyta, kad net maţomis koncentracijomis juodųjų serbentų lapų ekstraktas slopina viruso prisitvirtinimą ląstelėje. Pagaminta patogi vartoti vaisto forma - sirupas, turtingas polifenoliniais junginiais, lemiančiais priešvirusinį preparato poveikį bei pasiţymintis antiksidaciniu aktyvumu. Darbo tikslas: pagaminti juodųjų serbentų lapų ir uogų sirupus, įvertinti ir palyginti jų kokybę. Darbo uždaviniai: 1. Surinkti ir susisteminti literatūrą apie juodųjų serbentų ţaliavoje esančias veikliasias medţiagas, jų veikimą, sirupų gamybos ypatumus ir analizės metodus, taikomus veikliųjų medţiagų kiekiui nustatyti bei sirupų kokybei reglamentuoti. 2. Parinkti sirupų sudėtį ir parengti gamybos procedūras gaminant sirupus iš juodųjų serbentų lapų ir sausojo uogų ekstrakto. 3. Parinkti ir pritaikyti analizės metodus polifenolinių junginių kiekio ir antioksidacinio aktyvumo nustatymui tiriamuose objektuose. 4. Atlikti sirupų stabilumo tyrimus, nustatant kokybę reglamentuojančius rodiklius. Metodika: Juodųjų serbentų lapų ekstrakcija buvo vykdoma ultragarso pagalba. Bendrasis fenolinių junginių kiekis juodųjų serbentų uogų, lapų ekstraktuose ir tiriamuosiuose sirupuose nustatytas pagal galo rūgšties ekvivalentą, spektrofotometriniu metodu. Antioksidacinis aktyvumas vertintas spektrofotometriniu DPPH laisvojo radikalo sujungimo metodu. Sirupų kokybei ir stabilumui vertinti tirta dinaminė klampa (viskozimetrija), santykinis tankis nustatytas areometro pagalba, lūţio rodiklis (refraktometrija), optinis tankis (poliarimetrija). Gautų rezultatų statistiniam apdorojimui naudotos Microsoft Office Excel 2007, Sigma Plot programos. Rezultatai ir išvados: Nustatyta, kad tyrimui naudotos ţaliavos, juodųjų serbentų lapai ir sausasis uogų ekstraktas yra kokybiški ir atitinka Europos farmakopėjos keliamus reikalavimus (Ph. Eur.). Nuodţiūvis juodųjų serbentų lapų ţaliavoje 8,307±0,02 proc., serbentų uogų sausajame ekstrakte 4,861±0,02 proc. Pagamintame serbentų lapų etanoliniame ekstrakte, naudojant ultragarsą, nustatytas ir apskaičiuotas didesnis bendrasis fenolinių junginių kiekis lapuose (19,9±0,03 mg/g) nei sausajame uogų ekstrakte (6,6±0,1 mg/g), tačiau uogų ekstraktas (1:10) pasiţymėjo stipresnėmis antioksidacinėmis savybėmis nei lapų ekstraktas (1:100). Pagamintuose cukraus sirupuose su 1, 2, 5 proc. etanolinio juodųjų serbentų lapų ekstrakto ir su 5 proc. sausojo uogų ekstrakto, bendrasis fenolinių junginių kiekis ir antioksidacinis aktyvumas

7 7 statistiškai reikšmingai didėja, didėjant pridėto ekstrakto kiekiui. Pagamintų sirupų kokybės įvertinimui nustatyti fizikiniai rodikliai: klampa, santykinis tankis, lūţio rodiklis, optinis tankis. Laikant sirupus įprastomis sąlygomis (21±2 C) ir klimatinėje kameroje kokybės rodikliai pakito nereikšmingai.

8 8 SUMMARY R. Valantinaitė. Master's thesis,,evalution of technology development and quality of blackcurrant syrup / Scientific leader doc. Dr. Z. Kalvėnienė; Lithuanian University of Health Sciences, Faculty of Pharmacy, Department of Drug Technology and Social Pharmacy. - Kaunas. World scientists in vitro and in vivo studies demonstrated blackcurrant (Ribes nigrum L.) leaf extract Ladania067 effect against influenza virus. Scientific studies with the H1N1 and H7N7 viruses have shown that even low concentrations of blackcurrant leaf extract weakens the virus anchoring in cell. Convenient form was made for use in medicine - syrup, rich in polyphenol compounds which determines antiviral effects and also has antioxidant qualities. The aim : to produce blackcurrant leaf and berry syrups, evaluate and compare their quality. Objectives: 1. Collect and organize literature of black currant material active substances, how they function, collect production characteristics and methods of analysis for the determination of the active substances for regulation of syrups quality. 2. Select syrup composition and manufacturing procedures to prepare the production of syrups from black currant leaves and dry berry extract. 3. Select and adapt the methods of analysis for polyphenolic compounds content and antioxidant activity in the target objects. 4. Perform syrups stability studies to determine the quality of governing indicators. Methodology: Blackcurrant leaf extraction was carried out by using help of ultrasound. Total amount of phenolic content in blackcurrant berries, leaves, extracts and syrups was set by gallic acid equivalent, using spectrophotometry method. Antioxidant activity was evaluated by spectrophotometric DPPH free radical scavenging method. For quality and stability evaluation of syrups dynamic viscosity ( viscosimetry ), relative density set with help of aerometer, refractive index ( refractometry ), optical density ( poliaritmetry ) were evaluated. Statistical analysis of the results was made by using Microsoft Office Excel 2007, Sigma Plot 12.0 software. Results and conclusions: It was found that the materials which were used in the investigation, black currant leaves and dried berries extract is high quality and meets the requirements of the European Pharmacopoeia (Ph. Eur.). The loss of blackcurrant leaves raw material 8,307 ± 0,02 per cent, Currant berries dry- extract 4,861 ± 0,02 percent. In produced ethanolic extract of currant leaves, using ultrasound, a higher total phenolic compounds was found in leaves (19,9 ± 0,03 mg/g) than in the dry- berry extract (6,6 ± 0,1 mg/g), but the berry extract (1:10) can be characterized by stronger antioxidant properties than the leaf extract (1: 100). In produced sugar syrup with containment of 1, 2, 5 percent. ethanol blackcurrant leaf extract and with 5 percent of dry berry extract, overall amount of phenolic compounds and antioxidant activity increases with the amount of extract added. For produced syrup quality assessment, these physical

9 9 indicators were evaluated: oil viscosity, density, refractive index, optical density. Holding the syrups under normal conditions (21±2 C) and in a climatic chamber indicators of quality has changed insignificantly.

10 10 PADĖKA Uţ suteiktas kokybiškas darbo sąlygas, dėkoju Lietuvos Sveikatos Mokslų Universiteto, Medicinos Akademijos, Vaistų technologijos ir socialinės farmacijos, Analizinės ir toksikologinės chemijos ir Vaistų chemijos katedroms. Norėčiau padėkoti savo darbo vadovei, doc. dr. Zenonai Kalvėnienei, uţ konsultacijas ir pastabas rengiant baigiamąjį magistro darbą. Uţ pagalbą ir patarimus dėkoju doc. dr. Giedrei Kasparavičienei ir asistentui Mindaugui Marksai.

11 11 ŽODYNĖLIS Ladania067 vandenyje tirpus juodųjų serbentų lapų ekstraktas Tamiflu sistemiškai veikiantis priešvirusinis vaistas, neuraminidazės inhibitorius Influenza virusas gripo virusas In vivo - procesas (bandymas, tyrimas), atliekamas arba stebimas gyvame organizme In vitro - bandymas, atliekamas dirbtinėje sistemoje Tromboksanas A2 kraujagysluų tonusą didinanti ir trombocitų agregaciją skatinanti medţiaga Replikacija DNR sintezė vykstanti prieš ląstelės dalijimąsi

12 12 ĮVADAS Vaistiniai augalai nuo seno buvo pagrindinė gydymo priemonė, nors vėliau cheminiai vaistai uţvaldė farmacijos rinką, tačiau šiuo metu stebimas gydymo augaliniais vaistais populiarumo didėjimas [1]. To prieţastis - geresnis tradicinių vaistų prieinamumas, įperkamumas bei per šimtmečius susiformavęs patikimumas [2]. Juodieji serbentai yra vaiskrūmiai, kilę iš Šiaurės Azijos, kur daugiau nei tūkstantį metų šių augalų uogos naudojamos kinų liaudies medicinoje [3]. Viduramţiais šiais augalais sėkmingai gydytos įvairios ligos: šlapimo pūslės akmenligė, kepenų susirgimai. Šaltiniuose minima, kad juodųjų serbentų uogų sirupu gydytas kosulys ir įvairios plaučių ligos [4]. Pagrindinai juodojo serbento cheminiai junginiai yra polifenoliai, suteikiantys augalui stiprias antioksidacines, antibakterines, dezinfekuojančias savybes [5]. Ypač plačiai tyrinėtas šio augalo poveikis influenza virusui, jau daugiau nei dešimtmetį atliekami įvairūs tyrimai in vivo, įrodantys tiek augalo uogų, tiek lapų poveikį šiam virusui [6, 7, 8, 9, 10]. Vokiečių mokslininkai, tyrę juodųjų serbentų lapus in vitro ir in vivo metodais, nustatė, kad jų ekstraktas sėkmingai slopina gripo virusą A ankstyvoje infekcijos stadijoje, nesukeldamas šalutinių poveikių, todėl gali būti naudojamos virusinių susirgimų profilaktikai [7]. Dėl priimtino skonio ir patogaus vartojimo sirupas yra viena iš seniausių vaisto formų, ypač populiari pediatrijoje, tačiau vartojama ir kitose amţiaus grupėse, siekiant uţmaskuoti nepriimtiną vaisto skonį ar esant rijimo sutrikimams [11]. Šiuo metu vaistinėje randamas gausus sirupų asortimentas, bet juodųjų serbentų tarp jų nėra. Tai paskatino sukurti populiarią vaisto formą, pasiţyminčią geromis juslinėmis savybėmis bei teigiamu poveikiu sveikatai, pasirenkant tinkamiausią sudėtį ir technologiją. Darbo tikslas - ištirti juodųjų serbentų sirupų gamybos galimybes, panaudojant sausąjį uogų ekstraktą ir serbentų lapų ekstraktą bei vertinti jų kokybę.

13 13 DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI Darbo tikslas: Ištirti juodųjų serbentų sirupų gamybos galimybes, panaudojant sausąjį uogų ekstraktą ir serbentų lapų ekstraktą bei vertinti jų kokybę. Darbo uždaviniai: 1. Surinkti ir susisteminti literatūrą apie juodųjų serbentų ţaliavoje esančias veikliąsias medţiagas, jų veikimą, sirupų gamybos ypatumus ir analizės metodus, taikomus veikliųjų medţiagų kiekiui nustatyti bei sirupų kokybei reglamentuoti. 2. Parinkti sirupų sudėtį ir parengti gamybos procedūras gaminant sirupus iš juodųjų serbentų lapų ir sausojo uogų ekstrakto. 3. Parinkti ir pritaikyti analizės metodus polifenolinių junginių kiekio ir antioksidacinio aktyvumo nustatymui tiriamuose objektuose. 4. Atlikti sirupų stabilumo tyrimus, nustatant kokybę reglamentuojančius rodiklius. Temos aktualumas ir praktinė reikšmė Juodieji serbentai pasiţymi plačiu farmakologiniu poveikiu. Jų ţaliavos turtingos polifenoliniais junginiais, kurių stiprus antioksidacinis aktyvumas in vitro įrodytas moksliniais tyrimais [5, 12, 13]. Juodųjų serbentų uogų ekstraktas inhibuoja respiracinio sinsitinio viruso (RSV) replikaciją, bei veikia gripo A ir B, Herpes simplex-1 virusus [8]. Lapų ekstraktas net labai maţomis dozėmis veikia prieš gripo viusą H1N1 [6]. Serbentų uogos ir jų lapai jau kelis amţius naudojami tradicinėje medicinoje. Prancūzijoje, Ispanijoje vartojama kapsuliuota juodųjų serbentų lapų ekstrakto forma, virškinimo sutrikimams, reumatiniam skausmui lengvinti [14]. Tačiau Lietuvoje nėra registruotų vaistinių preparatų, kurių sudėtyje yra šio augalo ţaliavos. Juodųjų serbentų uogos naudojamos tik kaip pagalbinė, skonį gerinanti medţiaga, maisto papilduose. Todėl nuspręsta pagaminti juodųjų serbentų lapų ir uogų sirupus, kurie pasiţymėtų priešvirusiniu, peršalimo simptomus slopinančiu poveikiu, įvertinti jų kokybę ir juos palyginti.

14 1. LITERATŪROS APŽVALGA 1.1. Juodųjų serbentų (lot. Ribes nigrum L.) apibūdinimas 14 Juodasis serbentas (Ribes nigrum L.) yra šakotas krūmas, turintis specifinį malonų kvapą. Jis plačiai kultivuojamas Europoje, Naujojoje Zelandijoje, dalyje Azijos, Rusijoje, maţiau Šiaurės Amerikoje. Augalas priklauso agrastinių (Grossulariaceae) šeimai [15]. 1 Lentelė. Mokslinė juodųjų serbentų klasifikacija [15] Karalystė augalai Skyrius magnolijūnai Klasė magnolijainiai Poklasis erškiačiaţiedţiai Šeima agrastiniai Gentis serbentas Pogentis serbentas Rūšis juodasis serbentas Augalas uţauga iki 2 metrų aukščio, pilnai subręsta ir pradeda duoti vaisių po 3-4 metų. Šio daugiamečio krūmo lapai yra praţanginiai, turintys 3-5 skiautes, ant jų pastebimi smulkūs plaukeliai, kraštai dantyti (1 pav.). Serbentų lapuose randama eterinių aliejų atsargų, kurį išskiria apačioje esančios liaukutės. Augalo pumpurai, kaip ir kitos jo dalys, yra aromatingi, jų forma gali būti verpstinė ar kūginė, spalva taip pat įvairi, daţniausiai gelsva ar rausva, intensyvėjanti [15, 16, 17]. Augalas ţydi balandţio ir geguţės mėnesiais. Tuomet juodasis serbentas sukrauna rausvai ţalsvus ţiedus. Iš vieno pumpuro išsiskleidţia apie 20 ţiedų, kurie yra sutelkti į 3-5 cm ilgio nusvirusias kekes, ant kurių matomi plaukeliai [17]. 1 pav..ribes nigrum (20)

15 15 Juodasis serbentas sunokina vaisius liepos - rugpjūčio mėnesiais, tai yra praėjus dienų po ţydėjimo, šis laikotarpis priklauso nuo augalo veislės. Vaisius yra sultinga uoga, turinti daug sėklų, pasiţyminti specifiniu aromatu. Uogos yra rutuliškos formos, lygiu paviršiumi. Vaisius pilnai subrendęs būna juodos arba tamsiai violetinės spalvos, apie 1 cm skersmens [15, 16]. Augalinė ţaliava yra prinokusios uogos (fructus Ribis nigri) ir lapai (folium Ribis nigri). Juodųjų serbentų pumpurai taip pat gali būti naudojami kaip ţaliava [15]. Ţaliavos renkamos tik sveikos, nepakenktos cheminių medţiagų. Pumpurai skinami dar neišsprogę ţiemą ar ankstyvą pavasarį. Lapų skynimui tinkamiausi birţelio ir liepos mėnesiai. Surinkta ţaliava dţiovinama. Pirmiausiai uogos vytinamos atviroje vietoje, vėliau dţiovinamos gerai vėdinamose patalpose. Optimali temperatūra uogų dţioviniui yra C. Lapų ţaliava ruošiama laikant juos pavėsyje ar dţiovykloje C temperatūroje. Norint įvertinti ţaliavos kokybę, būtina stebėti juslines savybes: uogos turi būti rūgštaus, aitroko skonio, pasiţymėti specifiniu kvapu. Lapai turi išlikti ţali ir kvapūs [16, 17] Juodųjų serbentų (lot. Ribes nigrum L.) lapų ir uogų cheminė sudėtis Juodųjų serbentų ţaliavų cheminė sudėtis intensyviai tyrinėjama jau daugiau nei 40 metų, tačiau kol kas nėra iki galo išaiškinta. Moksliniais tyrimais vis dar atrandama naujų cheminių junginių, lemiančių augalo biologinį aktyvumą. Šiuos tyrimus skatina vykdyti didėjantis susidomėjimas natūraliais antioksidantais, daţikliais. [15, 18, 19]. Pagrindiniai serbentų komponentai yra fenoliniai junginiai, randami dideliais kiekiais tiek augalo uogose, tiek ir lapuose [5]. Uogų cheminė sudėtis: Sultingose, sunokusiose uogose randama iki 85 proc. vandens, apie 4 proc. ląstelienos. Cukraus kiekis uogose būna įvairus, svyruoja nuo 4,5 iki 16,8 proc. Daţniausiai aptinkami cukrūs yra fruktozė, gliukozė bei sacharozė [16, 20]. Ţaliava ypač turtinga vitaminais, kurių pagrindą sudaro vitaminas C. Jo kiekis juodųjų serbentų uogose gali svyruoti nuo 100 iki 450 mg/100 ml uogų sulčių, priklausomai nuo augalo veislės [15, 16] metais Belgijoje atliktame juodųjų serbentų ţaliavų cheminės sudėties tyrime, uogose nustatyta 235 mg/100 g askorbo rūgšties [12]. Lietuvos sodininkystės ir darţininkystės institute 2008 metais, atlikus tyrimą su keliomis juodųjų serbentų veislėmis, pastebėta kad C vitamino kiekiai kinta uogom nokstant, o didţiausia jo koncentracija randami nokimo pradţioje [21]. Fenoliniai junginiai yra vieni svarbiausių ir plačiausiai tyrinėjamų cheminių junginių serbentų uogose. Nustatytas jų kiekis labai įvairus, kai kurių veislių augaluose gali siekti net 60 mg/g švieţios ţaliavos [5, 12, 22]. Pagrindiniai fenoliniai junginiai randami juodųjų serbentų uogose: flavonoidai, fenolinės rūgštys, taninai, lignanai, stilbenai [15]. Vyraujantys antocianinai juodųjų serbentų uogose yra cianidino 3-O-rutinozidas, delfinidino 3-O-rutinozidas ir

16 16 delfinidino 3-O-gliukozidas [18]. Be šių junginių uogose randama įvairių cheminių mikroelementų [16]. Lapų cheminė sudėtis: juose aptinkami eteriniai aliejai. Didţiąją jo dalį sudaro monoterpenoidai: alfa pinenas, mircenas, limonenas [23]. Fenoliniai junginiai yra vieni iš pagrindinių augalo lapų cheminių komponentų. Remiantis atliktų tyrimų parodymais, jų kiekiai yra didesni nei augalo uogose. Polifenolių kiekis lapuose gali svyruoti nuo 20 iki 87 mg/g ţaliavos. Tai priklauso nuo augalo veislės, lapų padėties augimo metu bei skynimo laiko [12, 24]. Pagrindiniai fenoliai randami lapuose yra kemferolis, kvercetinas, miricetinas, proantocianidinai [24] metais Serbijoje atliktame tyrime nustatyti jų kiekiai atitinkamai: kvercetino (84±2,4 mg/g), kempferolio (43,6±1,6 mg/g) bei miricetino (9,5±0,4 mg/g) [25]. Kitas Lenkijos mokslininkų atliktas tyrimas parodė, kad 68 proc. viso fenolių kiekio lapų ekstrakte sudaro flavonoidai. [26] Juodųjų serbentų (lot. Ribes nigrum L.) gydomosios savybės Juodųjų serbentų lapai jau nuo seno naudojami liaudies medicinoje reumato, artrito, kvėpavimo, bei šlapimo takų ir odos susirgimų gydymui [17, 25]. Jau daugelį metų ţinoma apie uogų gydomąjį poveikį, sergant podagra ar hemorojumi, jų vartojimą kaip vitaminų šaltinį [16]. Šiuo metu atliekama vis daugiau tyrimų, įrodančių juodojo serbento naudą mūsų sveikatai Antivirusinis aktyvumas Virusinių susirgimų gydymas daţnai būna problematiškas. Pasaulyje registruoti tik dviejų klasių vaistai veikiantys prieš gripo virusus. Vokiečių mokslininkai susidomėjo juodųjų serbentų lapų atntivirusiniu aktyvumu metais tirtas vandenyje tirpaus lapų ekstrakto (Ladania067) antivirusinis poveikis in vitro ir in vivo, jis lygintas su,,tamiflu". Rezultatai parodė panašų Ladania067 priešvirusinį aktyvumą lyginant su,,tamiflu pelėms intranazaliniu būdu. Nustatytas didţiausias tiriamojo preparato aktyvumas, vartojant jį prieš viruso patekimą į organizmą [7]. Juodųjų serbentų lapų antivirusinis aktyvumas siejamas su viruso prisitvirtinimo ląstelėje slopinimu. Dar išsamiai neištirta, kurie cheminiai junginiai lemia priešvirusinį veikimą. Tačiau manoma, kad svarbūs yra epigalokatechinai (EGC), tokie kaip epigalokatechino galatas (EGCG), epikatechinas (ECG), dideliais kiekiais randami serbentų lapuose metais Vokietijoje įrodyta, kad Ladania067 ekstraktas, kurio koncentracija 0,2 mg/ml visiškai inhibuoja gripo viruso H1N1 replikaciją, o vartojant preparatą veiksmingomis dozėmis (iki 100 mg/ml), nepastebima jokio ţalingo poveikio organizmui [6,

17 17 7]. Tyrimais buvo patvirtinta, kad priešvirusinis juodųjų serbentų uogų poveikis tiesiogiai proporcingas polifenolinių junginių kiekiui jose [10]. Japonijoje taip pat tyrinėtas juodųjų serbentų, augintų Naujojoje Zelandijoje bei Lenkijoje, uogų ekstrakto poveikis 4 tipų gripo virusams: IFV- AH1pdm, IFV-AH3, IFV-AH1tam(r), IFV-B. Vertintas viruso adsorbcijos slopinimas. Palyginimui atliktas mėlynių uogų ekstrakto antivirusinio poveikio tyrimas. Jo metu nustatyta, kad 10-ties proc. serbentų uogų ekstraktas visiškai inhibuoja minėtų virusų adsorbciją ląstelėse, tačiau 10-ties proc. mėlynių uogų ekstraktas neturi inhibuojamo poveikio IFV-AH3, IFV-AH1tam(r) virusams. Tyrimo metu nepastebėta reikšmingo antivirusinio poveikio skirtumo tarp Naujoje Zelandijoje ir Lenkijoje kultivuotų uogų [9]. Nustatyta, kad juodųjų serbentų uogų ekstraktas, kurio koncentracija siekia vos 1 proc., sėkmingai inhibuoja RSV replikaciją. Šis virusas yra daţna naujagimių ir kūdikių apatinių kvėpavimo takų infekcijų prieţastis. Taip pat šis ekstraktas veikia gripo A ir B viruso atmainas bei Herpes simplex-1 virusus, o 10-ties proc. ekstraktas slopina daugiau nei 95 proc. šių virusų adsorbciją ląstelės paviršiuje [8] Antimikrobinis ir priešuždegiminis poveikis Be stipraus antivirusinio poveikio, juodieji serbentai pasiţymi antimikrobiniu aktyvumu. Uogų ekstraktas slopinančiai veikia gram+ ir gram- mikroorganizmus. Atliktais tyrimais yra įrodytas poveikis šiems mikroorganizmams: Staphylococcus aureus, Enterococcus faecalis, Shigella flexneri, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa bei Salmonella enteritidis. Nustatytas stipresnis antibakterinis poveikis gram- patogenams. Šis poveikis siejamas su dideliu kiekiu antocianinų, randamų juodųjų serbentų uogose [27] m. Japonijoje buvo nustatyta, jog 10-ies proc. juodųjų serbentų uogų ekstraktas turi stiprų dezinfekuojantį poveikį prieš H. Influenzae. Prieš tai minėtos koncentracijos uogų ekstraktas veiksmingai sunaikina net 99,8 proc. šio mikrobo [8]. Vokietijoje atliktame tyrime, iš 43-jų augalų buvo pagaminti jų metanoliniai ekstraktai bei vertitas šių ekstraktų priešuţdegiminis veikimas. Visuose ekstraktuose nustatytas didelis fenolinių junginių kiekis. Įrodyta, kad juodųjų serbentų lapų ekstraktas stipriausiai slopina fosfolipazę A2α, fermentą, kuris lemia uţdegiminius procesus, sergant tokiomis ligomis kaip astma, artritas bei kitos alerginės ar neuroninės ligos. Taip pat tyrime nustatyta, kad 100 μg/ml konc. metanolinis juodųjų serbentų lapų ekstraktas slopina apie 70 proc. fosfolipazės A2α. Tačiau, įvertinus fenolinių junginių kiekius tiriamuosiuose augaluose, nepastebėta priklausomybė tarp jų ir priešuţdegiminio aktyvumo [13].

18 Kitas juodųjų serbentų farmakologinis aktyvumas m. Lenkijoje atliktame tyrime, įrodytas teigiamas juodųjų serbentų poveikis širdies ir kraujagyslių sistemai: endotelio funkcijai, kraujospūdţiui, lipidų kiekiui [28]. Nustatyta, kad 2,5-15 μg/ml koncentracijos juodųjų serbentų lapų ekstraktas, aktyvuoja NO (azoto monoksido) sintezę venų endotelio ląstelėse. Dėl to sumaţėja kraujagyslių sienelių paburkimas, slopinamas trombocitų formavimasis, maţėja sklerozės rizika [26]. Antocianais turtingos uogos pasiţymi neuroprotekciniu poveikiu [29]. Japonų mokslininkai aprašė juodųjų serbentų vaisių sulčių imunostimuliacinį ir priešvėţinį veikimą, dėl uogose randamų polisacharidų [30]. Juodųjų serbentų nektaras maţina raumenų paţeidimą fizinio krūvio metu [31]. Nustatyta, kad šis augalas turi savybių uţkirsti kelią metabolinio sindromo vystymuisi, maţindamas organizmo atsparumą insulinui, gerindamas gliukozės toleranciją, reguliuodamas riebalų ir cholesterolio kiekį [32]. Pastaraisiais metais, pradėta domėtis juodaisiais serbentais dermatologijos srityje. Išaiškinta, kad hidrofiliniai junginiai skatina odos ląstelių aktyvumą, taip pat uogose esantys nesotieji trigliceridai bei riebieji aliejai teigiamai veikia odos būklę [33] Fenoliniai junginiai ir jų aktualumas Fenoliniai junginiai yra natūralūs augaliniai komponentai, kurie susidaro augalo antrinio metabolizmo metu. Tai daţniausiai vartojami augalinės kilmės produktai. Natūralūs fenoliniai junginiai sulaukia ypač didelio susidomėjimo dėl savo neuro-, kardioprotekcinių, priešvėţinių savybių [15, 33]. Raktinio ţodţio,,fenoliniai junginiai, publikacijų skaičius m., išaugo beveik dvigubai (2 pav.) [34]. 2 pav. Publikacijų skaičius,, fenoliniai junginiai [34] Fenolinių junginių struktūros pagrindą sudaro vienas ar keli aromatiniai ţiedai ir prie jų prisijungusios hidroksilo grupės. Jų išsidėstymas lemia struktūros skirtumus. Atsiţvelgiant į juos

19 19 fenoliniai junginiai, skirstomi į grupes ir pogrupius. Cheminė struktūra lemia jų antioksidacinį aktyvumą [35, 36]. Fenoliniai junginiai suteikia augalams apsaugą nuo kenkėjų, yra svarbūs jų augimui bei reprodukcijai. Ţmogaus organizme jie pasiţymi antioksidacinėmis, priešvirusinėmis, priešuţdegiminėmis, trombocitų agregaciją slopinančiomis savybėmis [12]. Atlikta daug tyrimų, kurių metu nustatyti polifenoliniai junginiai juodųjų serbentų uogose, lapuose, pumpuruose [5, 12, 24, 10, 37]. Bendras šių junginių kiekis lapuose yra didesnis nei tokių augalų kaip ankstyvasis šalpusnis ar vaistinė kraujalakė [13]. Juodųjų serbentų uogose nustatomas maţesnis bendrasis fenolinių junginių kiekis nei lapuose. Tačiau uogos ypač turtingos antocianinais, kurie kaip manoma apsprendţa stiprų šios ţaliavos antioksidacinį aktyvumą [38] Flavonoidai plačiai nagrinėjama fenolinių junginių grupė Flavonoidai yra plačiausiai tyrinėjami ir pritaikomi fenoliniai junginiai. Šių junginių nustatyta daugiau nei 4000 rūšių. Šie aktyvūs komponentai aptinkami daugelyje augalų. Jų randama dideliais kiekiais ir juodųjų serbentų uogose bei lapuose [24]. Augaluose randami flavonoidai daţniausiai būna sujungti su cukraus molekule. Atlikta daugybė tyrimų, įrodančių šių junginių teigiamą poveikį biologinėms sistemoms. Nustatytas atvirkštinis ryšys tarp suvartojamo flavonoidų kiekio ir širdies bei kraujagyslių susirgimų. Taip pat moksliniais tyrimais pagrįstas jų priešvėţinis, priešuţdegiminis, antioksidacinis aktyvumas [39, 40]. Priešuţdegiminis flavonoidų poveikis aiškinamas uţdegiminių mediatorių metabolitų formavimosi slopinimu. Veikdami ciklooksigenazę (COX) ir lipooksigenazę (LOX) flavonoidai inhibuoja tromboksano A2 gamybą, slopindami trombocitų agregaciją, todėl pasiţyminti kardioprotekciniu poveikiu [13, 39]. Įrodyta, jog širdies ir kraujagyslių susirgimų riziką maţina antilipideminis flavonoidų poveikis, kuomet dėl antioksidacinio poveikio yra stabdomas maţo tankio lipoproteinų oksidacijos procesas. Antioksidacinis laisvuosius radikalus surišantis poveikis flavonoidams suteikia priešvėţines savybes. Dėl to stabdomas ląstelių mutavimas, navikinių ląstelių maitinimas bei aprūpinimas krauju [39]. Antimikrobiškai ši fenolinių junginių grupė gali veikti keliais būdais: slopinti bakterijų augimą, sutrikdyti mikroorganizmų prisitvirtinimą organizme [27]. Įrodytas ir priešvirusinis flavonoidų poveikis: jie slopina viruso adheziją ląstelės paviršiuje ir jo replikaciją (3pav.) [8, 41]. Flavonoidai randami daugelyje vaistinių augalų, todėl intensyviai vykdomi jų tyrimai. Šių cheminių komponentų turi ir juodieji serbentai. Tai yra viena geriausiai ištirtų fenolinių junginių grupių serbentuose. Manoma, kad flavonoidai yra pagrindiniai biologiškai aktyvūs komponentai juose, kurie suteikia didelį antioksidacinį aktyvumą augalui [24]. Tačiau ne tik kiekybinė, bet ir kokybinė

20 20 flavonoidų sudėtis lemia laisvųjų radikalų surišimo gebą [38]. Atliktuose tyrimuose įrodytos juodųjų serbentų gydomosios savybės, būdingos flavonoidams. Priešvėžinis Kardioprotekcinis Priešgrybelinis Flavonoidai Antimutageninis Antivirusinis Imuninę sistemą stiprinantis 3 pav. Flavonoidų terapinis poveikis [24, 39, 41] 1.6. Sirupai Sirupas yra tirštos konsistencijos vaisto forma, pasiţyminti saldţiu skoniu. Klampumą šiam gaminiui suteikia vandeniliniai ryšiai tarp vandens ir ištirpusių cukrų, tačiau kaip tirpiklis be vandens dar gali būti naudojama įvairių uogų, vaisių ar kitų augalo dalių sultys. Nors sirupai pradėti gaminti jau senai, tačiau cukraus sirupas, kaip vaisto forma atrastas apie XVI amţių. Vėliau, kaip pagrindiniai sirupo komponentai, pradėti naudoti gliukozė ar fruktozė. Sirupai daţniausiai naudojami pediatrijoje. Apie 80 proc. vaistų vartojamų šioje amţiaus grupėje yra skystosios formos, o didţiąją dalį jų sudaro sirupai [42]. Skiriamos dvi sirupų grupės: vaistiniai ir skonį koreguojantys sirupai. Pirmajai grupei priskirimai preparatai, kurių sudėtyje yra vaistinių medţiagų ar įvairių augalinių sirupų, tokių kaip: rabarbarų, erškėčių, svilaroţių, alavijų ar kt., turinčių teigiamą poveikį ţmogaus sveikatai [43, 44]. Skonį gerinantys sirupai naudojami paslėpti nemalonų vaistinių medţiagų skonį. Jie neturi jokių aktyvių ingredientų, o jų pagrindą sudaro paprastasis cukraus sirupas [2].

21 21 Sirupo gamybai taikomi du metodai: karštasis, kurio metu cukrus yra tirpinamas verdančiame vandenyje ir perkoliacijos metodas, nenaudojant šildymo. Pastarasis metodas sirupo gamybai naudojamas rečiau dėl keleto prieţasčių: ilgesnis gamybos laikas lyginant su karštuoju metodu, reikalinga sudėtingesnė aparatūra (perkoliatorius). Taip pat šiuo metodu nepašalinami baltymai ir gleivės. Vis dėl to, šaltiniuose minimas ir trečias gamybos metodas plakimas be šildymo. Jis naudojamas dirbant su termolabiliomis, lakiomis medţiagomis [43, 45]. Cukraus sirupo gamybai naudojamas išgrynintas vanduo, cukrus (daţniausiai sacharozė), tačiau gali būti naudojami ir kiti pakaitalai, kurie suteikia sirupui klampumą bei saldų skonį, tokie kaip aspartamas ar sacharinas, kurių vartojimas priimtinas ir cukriniu diabetu sergantiems pacientams. Be šių pagrindinių komponentų gali būti pridedama antimikrobinių konservantų, tirštiklių, stabilizatorių, daţiklių ar aromatą suteikiančių medţiagų [45]. Optimalu naudoti proc. cukraus koncentraciją, tačiau kituose šaltiniuose teigiama, kad ji gali siekti iki 85 proc. [45]. Gamybos metu pirmiausiai šildomas išgrynintas vanduo (jo temperatūra gali svyruoti nuo 60 iki 70 ºC), tuomet maišant tirpinamas cukrus. Gautas tirpalas turi būti uţvirintas du kartus, susidariusias putas privaloma nugraibyti, pašalinant gleives ir pektinus. Po to filtruojama arba košiama. Kokybiškas sacharozės sirupas turi būti skaidrios išvaizdos, bekvapis, tirštos konsistencijos saldus skystis, tirpalo reakcija turi būti neutrali [43]. Cukraus sirupo fizikinių rodiklių normos pagal Austrijos farmakopėją: tankis nuo 1,290 iki 1,320, lūţio rodiklis nuo 1,445 iki 1,455 [46]. Sirupas, kaip vaisto forma, yra naudojama dėl keleto prieţasčių: malonus skonis ir kvapas, patogus ir lengvas dozavimas [47]. Sirupas yra palanki terpė daugintis mikroorganizmams, ypač kai cukraus koncentracija yra maţesnė nei 66 proc. Siekiant išvengti šio preparato rūgimo ar kitų pokyčių, rodančių vaisto formos nestabilumą, naudojami konservantai. Jie privalo turėti platų veikimo spektrą, apimantį gram+ ir grammikroorganizmus, grybelius, būti netoksiški ir išlikti stabilūs visą preparato vartojimo laiką [43, 45]. Daţnai vaistinių sirupų konservavimui naudojamas etanolis (koncentracija nuo 2,3 iki 20 proc.) [42]. Kaip konservantai yra naudojami glicerolis, natrio benzoatas, benzilkarboksirūgštis ar nipagino bei nipazolio mišinys (parahidroksibenzoinės rūgšties esterių 9:1), kalio sorbatas [11]. Pastarasis, dėl maţesnio toksiškumo lyginant su kitais konservantais, naudojamas ne tik vaistų stabilumui uţtikrinti, bet ir maisto, gėrimų pramonėje [48]. Sirupų stabilizavimui daţniausiai naudojama 0,1-0,2 proc. konservantų koncentracija [47].

22 1.7. Literatūros apžvalgos apibendrinimas 22 Juodieji serbentai plačiai kultivuojami visame pasaulyje. Augalinė ţaliava, t.y. lapai ir uogos nuo seno naudojami liaudies medicinoje reumatiniams, artritiniams skausmams, podagros ar avitaminozės gydymui, esant peršalimui ar sergant hemarojumi. Juodųjų serbentų lapai, pumpurai ir uogos turtingi vitaminais bei fenoliniais junginiais, kurių didţiąją dalį sudaro flavonoidai. Lapuose šių junginių aptinkama daugiau nei serbentų uogose, tačiau, ţaliavų uogų antioksidacinis aktyvumas nustatomas didsnis, dėl jose esančių antocianinų. Moksliniais tyrimais įrodytas antivirusinis, antimikrobinis juodųjų serbentų aktyvumas, jų teigiamas poveikis širdies ir kraujagyslių sistemai, pritaikomumas onkologijos, dermatologijos srityse. Vokiečių, Japonijos, Naujosios Zelandijos, Lenkijos ir kt. šalių mokslininkai savo tyrimuose įrodė juodųjų serbenetų augalinės ţaliavos priešvirusinį poveikį ir nustatė veikimo mechanizmą. Sirupai yra patogi vartoti farmacinė forma, populiari ne tik gydant pediatrinius pacientus. Ji naudojama, kuomet sunku vartoti preparatus kitomis farmacinėmis formomis ar siekiama paslėpti nemalonų veikliųjų medţiagų skonį. Cukraus koncentracija sirupuose turi būti ne maţesnė kaip 66 proc., kuriai esant mikroorganizmai nesidaugina. Maţesnės cukraus koncentracijos sirupams reikalingos konservuojančios medţiagos. Siekant apsaugoti sirupus nuo mikroorganizmų, pakanka 0,1 0,2 proc. koservuojančių medţiagų. Pirmenybė teikiama saugesniems konservantams.

23 23 2. TYRIMO METODIKA IR METODAI 2.1. Darbo objektai Juodųjų serbentų lapai Juodųjų serbentų uogų ekstraktas Juodųjų serbentų lapų sirupas Juodųjų serbentų uogų sirupas 2.2. Darbe naudotos medžiagos ir prietaisai Medžiagos: Išgrynintas vanduo (LSMU laboratorija) Etanolis 96 proc. (UAB Stumbras, Lietuva) Folin - Ciocalteau fenolinis reagentas ( Sigma Aldrich, Vokietija) DPPH 2,2-difenil-1-pikrilhidrazil hidratas ( Sigma Aldrich, Vokietija) Na 2 CO 3 natrio karbonatas ( Sigma Aldrich Chemie GmbH, Šveicarija) Kalio sorbatas ( Sigma Aldrich, Vokietija) Cukrus (AB Nordic Sugar Kėdainiai, Lietuva) Juodųjų serbentų lapai (Belgija) Juodųjų serbentų uogų sausasis ekstraktas (Prancūzija) Prietaisai: Drėgnomatis (KERN MLS,Vokietija) Viskozimetras Sine wave Vibro Viscometer SV 10 (A&D Company ltd., Japonija) Refraktometras IRF-454BM (Rusija) Areometras AS-3 (Rusija) Spektrofotometras Shimadzu 1800 (Japonija) Ultragarso vonelė Bandelin DT156HB ( Vokietija) Poliarimetras A. Krüss optronic GmbH P8000 T (Vokietija) Sietai Ø 300μm, 4000μm (Fisher Scientifie GmbH, Vokietija) Automatinės pipetės (Ependorf, Didţioji Britanija) Analitinės svarstyklės ( Metler Toledo, Šveicarija) Klimatinė kamera CLIMACELL (MMM Medcenter Einrichtungen GmbH, Vokietija) Kaitinimo plytelė 5006 CB EKP (Bomann, Vokietija)

24 Augalinės žaliavos tyrimai Nuodžiūvio nustatymas gravimetriniu metodu juodųjų serbentų lapuose ir uogų sausajame ekstrakte. Nuodţiūvio nustatymui naudotas drėgnomatis KERN MLS (Vokietija). Tiriamasis mėginys (apie 1,0 g), patalpinamas ant prietaiso lėkštelės ir dţiovinamas 105 ºC temperatūroje iki nekintamos masės. Prietaisu įvertinta juodųjų serbentų dţiovintų lapų ir sausojo uogų ekstrakto drėgmė. Tyrimas kartotas tris kartus, apskaičiuotas šių tyrimų rezultatų vidurkis. Drėgmės kiekis lapų ţaliavoje turi neviršyti 13 proc., sausajame augaliniame ekstrakte 5 proc. [49]. Augalinės žaliavos smulkumo nustatymas. (Eur. Ph. 01/2011, 2.1.4). Atliktas juodųjų serbentų lapų ţaliavos tyrimas, siekiant atskirti norimą ţaliavos frakciją, naudojant sietus. Tyrimui naudota ţaliava, išbirusi pro 4000 µm sietą. Smulkinimo metu atsiradusios smulkiosios dalelės prasijotos pro 300 µm sietą. Buvo sijojama po 100,0 g susmulkintos ţaliavos. Pro sietus prabirusios ir neprabirusios frakcijos pasvertos, (galima paklaida ±0,1 g) apskaičiuoti procentiniai jų kiekiai Juodųjų serbentų lapų ekstrakto gamyba Ekstraktas buvo gaminamas santykiu 1:10. Gamybai naudota ţaliava, išbirusi pro 4000 µm sietą ir neprabirusi pro 300 µm sietą. 10,0 g paruoštos ţaliavos stikliniame inde uţpilta 100 ml 70 proc. etanoliu ir ekstrahuota uţdengus ultragarso vonelėje 15 minučių esant 24 ºC temperatūrai. Ekstraktas filtruotas pro stiklo filtrą Nr 1, papildyta 70 proc. etanoliu iki 100 ml [18, 24]. Ekstrakcija ultragarso bangomis ypatinga tuo, kad ekstrahuojamas mišinys šildomas vienodai visos ekstrakcijos metu. Dėl šios prieţasties ląstelių viduje sukeliamas staigus temperatūros pakilimas, ląstelių sienelės suyra. Todėl į ekstrahentą lengviau patenka medţiagos, kurias norima išekstrahuoti. Taip sutrumpinamas ekstrakcijos laikas. Dėl aukštos dielektrinės konstantos tikamiausias ekstrahentas ekstrakcijai ultragarso bangomis, etanolio ir vandens mišinys [50, 51] Sirupų gamyba Sirupai gaminti karštuoju būdu, tirpinant cukrų išgrynintame vandenyje. Vanduo šildomas ant kaitinimo plytelės iki 70 ºC, pridedamas cukrus ir maišoma kol ištirpsta. Gautas cukraus tirpalas uţvirintas du kartus, nugriebtos susidariusios putos ir įterpti juodųjų serbentų lapų etanolinis ekstraktas ar uogų sausasis ekstraktas. Dedamas konservantas kalio sorbatas. Gauti sirupai košti pro dvigubą marlės sluoksnį. Sirupų gamybos schema pateikta 4 pav.

25 25 Cukraus tirpinimas Sirupo virimas Ekstrakto pridėjimas Konservanto pridėjimas Košimas Masės koregavimas Išpilstymas 4 pav. Sirupų gamybos schema 2.6. Bendrojo fenolinių junginių kiekio nustatymas spektrofotometriniu metodu Bendrajam fenolinių junginių kiekiui nustatyti naudotas spektrofotometrijos metodas, atliekant reakciją su Folin-Ciocalteu fenoliniu reagentu, naudojant spektrofotometrą UV-1800 Shimadzu (Japonija). Atliekama spalvinė reakcija. 5 ml Folin-Ciocalteu vandeninio tirpalo (1:10) sumaišoma su 1 ml tiriamojo tirpalo ir 4 ml 7,5 proc. natrio karbonato tirpalo. Tirpalas paliekamas stovėti 30 min., kol įvyksta reakcija tirpalo spalva pakinta į melsvą. Spektrofotometru matuojami tirpalų optiniai tankiai esant 750 nm bangos ilgiui. Palyginamieji tirpalai 70 proc. etanolis ir išgrynintas vanduo. Rezultatai apskaičiuoti galo rūgšties ekvivalento miligramais viename mililitre ekstrakto (GRE mg/ml) [52]. Bendrasis fenolinių junginių kiekis serbentų lapų ekstrakte nustatytas naudojant 1 ml 1:10 ekstrakto skiesto 70 proc. etanoliu 1:100. Bendrasis fenolinių junginių kiekis sausajame uogų ekstrakte, nustatytas naudojant 1 ml ekstrakto vandeninį tirpalą (1:10) praskiestą 100 kartų. Bendrasis fenolinių junginių kiekis tiriamuosiuose sirupuose nustatytas naudojant 1 ml tiriamojo lapų sirupo ar 1 ml tiriamojo uogų sirupo vandeninį tirpalą paruoštą santykiu 1:10. Tyrimams buvo paruošta po tris mėginius, rezultatai pateikti išvedus aritmetinius vidurkius su vidutinėmis standartinėmis paklaidomis.

26 Antioksidacinio aktyvumo nustatymas 2,2-difenil-1-pikrilhidrazilo laisvojo radikalo inaktyvinimo metodu Antioksidacinis aktyvumas įvertintas naudojant DPPH (2,2-difenil-1-pikrilhidrazilas) laisvojo radikalo surišimo metodiką. Spalvinės reakcijos metu DPPH tirpalo spalva iš purpurinės pakinta į geltoną, nes reaguodamas su antioksidantais DPPH laisvasis radikalas prisijungia protoną [36]. 5 pav. DPPH radikalo reakcija su antioksidantu [34] Antioksidacinio aktyvumo nustatymas serbentų lapų etanoliniame ekstrakte 1,0 ml paruošto serbentų lapų ekstrakto praskiedţiama 70 proc. etanoliu iki 100 ml. Kiuvetėje sumaišoma 0,4 ml tiriamojo tirpalo ir 2,6 ml 0,1 mmol/konc. etanolinio DPPH tirpalo. Sumaišyti tirpalai paliekami 30 min. tamsoje. Antioksidacinio aktyvumo nustatymas serbentų uogų sausajame ekstrakte Sausojo uogų ekstrakto vandeninio tirpalo (1:10) 1,0 ml skiedţiamas išgrynintu vandeniu iki 10 ml. Kiuvetėje sumaišoma 0,3 ml tiriamojo tirpalo ir 2,7 ml 0,1 mmol/konc. etanolinio DPPH tirpalo. Sumaišyti tirpalai paliekami 30 min. tamsoje. Antioksidacinio aktyvumo nustatymas serbentų lapų sirupe 0,4 ml 1 %, 2 %, 5 % lapų sirupo kiuvetėse sumaišoma su 2,6 ml DPPH tirpalo. Sumaišyti tirpalai paliekami 30 min. tamsoje. Antioksidacinio aktyvumo nustatymas serbentų uogų sirupe Filtruotas uogų sirupas skiedţiama išgrynintu vandeniu 10 kartų. Imama 0,3 ml skiesto sirupo ir kiuvetėje sumaišoma su 2,7 ml DPPH tirpalo. Sumaišyti tirpalai paliekami 30 min. tamsoje. Susidarius nuosėdoms tirpalai buvo filtruojami pro filtrą su Ø 0,45 µm angelėmis. Matavimai atlikti spektrofotometru esant 517 nm bangos ilgiui. Lyginamieji tirpalai 70 proc. etanolis ir išgrynintas vanduo. Rezultatai apskaičiuoti remiantis formule: DPPH surišimas = [(Ab-Aa)/Ab] 100%;

27 27 kur: Ab standartinio tirpalo absorbcija (gryno DPPH tirpalo optinis tankis); Aa tiriamojo tirpalo absorbcija; DPPH surišimas inaktyvuoto DPPH kiekis procentais. Kiekvienas mėginys matuotas tris kartus, rezultatai pateikti išvedus aritmetinius vidurkius su vidutinėmis standartinėmis paklaidomis Sirupų klampos nustatymas Pagamintų sirupų klampa nustatyta viskozimetru wave Vibro Viscometer SV 10 (A&D Company ltd., Japonija). Matavimai atlikti esant 20 ºC temeperatūrai. Naudojant veleną L2. Į stiklinį indą įpilama apie 50 ml tiriamojo sirupo. Į jį panardinamos viskozimetro šakutės, kad velenas būtų paniręs iki ţymos. Pradėjus matavimą velenas pradeda suktis, jo greitis nusistovi, fiksuojami klampos duomenys (mpa*s) tuomet, kai pamatuota klampa ne maţesnė nei 15 proc. ir ne didesnė 100 proc. palyginus su didţiausia šiuo velenu išmatuojama klampa Lūžio rodiklio nustatymas Sirupų lūţio rodiklių nustatymui naudojamas refraktometras IRF-454BM (Rusija). Matavimo pradţioje nustatomas išgryninto vandens lūţio rodiklis refraktometro nulinis taškas (1,3330, esant 20 ºC temperatūrai). Tiriamojo sirupo 1-2 lašai lašinami ant apatinės refraktometro prizmės, kamera uţdaroma. Nustatoma ryški riba tarp juodo ir balto lauko, kuri eitų per dviejų sukryţiuotų linijų susikirtimo tašką okuliaro lange. Matavimai atliekami 0,0001 tikslumu, tris kartus, apskaičiuojamas aritmetinis vidurkis Santykinio tankio nustatymas Tiriamųjų sirupų tankiui nustatyti naudotas areometras AS-3 (Rusija). Matavimai atlikti esant 20 ºC temperatūrai. Prietaisas panardinamas į cilindrą su tiriamuoju skysčiu, areometrui neliečiant indo sienelių, rezultatai nustatomi pagal apatinį skysčių meniską, po 3-4 min. Matavimai atlikti tris kartus.

28 Optinio aktyvumo tyrimas - poliarimetrija Tyrimas naudojamas norint nustatyti optiškai aktyvios medţiagos savąjį poliarizacijos plokštumos sukimą ir koncentraciją. Poliarizacijos plokštumos sukimo metodu tiriama kristalinių medţiagų ir organinių molekulių sandara, baltymų erdvinė struktūra ir jos pokyčiai, esant įvairioms sąlygoms, nustatoma optiškai aktyvių terpių koncentracija. Poliarimetrija plačiai taikoma medicinoje ir molekulinėje biologijoje (kraujo serumo baltymų optiniam aktyvumui, diagnozuojant susirgimus vėţiu, nustatyti), klinikinėje medicinoje (cukraus kiekiui šlapime nustatyti), maisto pramonėje (cukraus kiekiui įvairiuose produktuose nustatyti) ten, kur reikia atpaţinti medţiagas [53]. Naudotas poliarimetras A. Krüss optronic GmbH P8000 T (Vokietija). Cukraus sirupas pilamas į kiuvetę, ji statomi į poliarimetrą. Prietaisu išmatuojamas ţinomos koncentracijos cukraus sirupo optinis aktyvumas arba patikrinama cukraus koncentracija, ţinant optinį aktyvumą. Matavimai atlikti tris kartus Stabilumo tyrimas Atlikti stabilumo tyrimai parodo vaistinės medţiagos ar vaistinio produkto pokyčius laikymo metu, kai veikia aplinkos faktoriai (pvz. temperatūra, drėgmė, šviesa). Jie atliekami siekiant numatyti vaistinio preparato tinkamumo laiką, rekomenduoti laikymo sąlygas. Preparatas nestabilus, jei laikymo metu pakinta jo išvaizda (keičiasi spalva, atsiranda drumstumas), kvapas, skonis, kitos fizikinės savybės (klampa, lūţio rodiklis), Gali pakisti biologiškai aktyvių junginių kiekis, lemiantis preparato terapinį poveikį [54]. Siekiant įvertinti vaistinio produkto ar medţiagos stabilumą laikymo metu, vertinamos jo fizikinės, juslinės, mikrobiologinės savybės, tiriami cheminių komponentų kiekybiniai pokyčiai [54]. Pagaminti sirupai išpilstyti į tamsaus stiklo buteliukus. Įvertinant pagamintų sirupų kokybę jie laikyti laboratorijos sąlygomis (21±2 С temperatūroje) ir klimatinėje kameroje (temperatūra 30±2 С, santykinė dregmė 70±5 proc.) [55]. Kas mėnesį tirti mėginių kokybės rodikliai: santykinis tankis, klampa, lūţio rodiklis, optinis tankis, antioksidacinis aktyvumas, bendrasis fenolių kiekis. Reikšmingu augalinio preparato stabilumo pokyčiu laikoma, kai aktyvių, fitoterapinį poveikį lemiančių junginių, kiekis pakinta ±5 proc., o veikliųjų medţiagų grupės kiekis ±10 proc. Išvaizdos, fizikinių rodiklių pokyčiai taip pat nusako preparato nestabilumą [54,56].

29 Statistinė duomenų analizė Gauti tyrimo rezultatai statistiškai buvo apdoroti, naudojant Windows Microsoft Office Excel 2007 ir Sigma Plot 12.0 programas, apskaičiuojant rezultato vidurkius, standartinius nuokrypius ir duomenų statistinį patikimumą. Vidurkiai patikimi, jei p 0,05.

30 30 3. REZULTATAI 3.1. Žaliavos kokybės vertinimas Nuodžiūvio nustatymas Ţaliavos nuodţiūvis juodųjų serbentų lapų ţaliavoje ir uogų sausajame ekstrakte nustatytas drėgnomačiu (KERN MLS, Vokietija), kartojant tyrimą tris kartus, pateikiamas rezultatų vidurkis. Nuodţiūvis juodųjų serbentų lapų ţaliavoje 8,307±0,02 proc., neviršyja leistinos normos 13proc. Nustatytas nuodţiūvis serbentų uogų sausajame ekstrakte 4,861±0,02, sausuose ekstraktuose leistina ne daugiau 5 proc. Sausojo juodųjų serbentų uogų ekstrakto nuodţiūvis atitinka sausiesiems augaliniams ekstraktams keliamus reikalavimus. Lapų nuodţiūvis atitinka Ph. Eur. augalinei ţaliavai keliamus reikalavimus Žaliavos dalelių smulkumo nustatymas Siekiant atskirti norimą ţaliavos frakciją, ţaliava sijota pro 4000 µm sietą, smulkiosios dalelės prasijotos pro 300 µm sietą. Buvo sijojama po 100,0 g susmulkintos ţaliavos. Pro sietus prabirusios ir neprabirusios frakcijos pasvertos, tyrimo rezultatai pateikti 2 lentelėje. Pagal Ph. Eu. reikalavimus, naudojant vieną sietą, pro jį turi prabirėti ne < 90 proc. ţaliavos masės. 2 Lentelė. Žaliavos smulkumo frakcijos (proc.) Ţaliavos kiekis neprabiręs pro 4000 µm sietą 3,19±0,08 Ţaliavos kiekis prabiręs pro 4000 µm sietą 94,60±0,39 Ţaliavos kiekis prabiręs pro 300 µm sietą 1,21±0,12 ± standartinis nuokrypis (Δ), n=3 Tyrimais nustatyta, kad juodųjų serbentų lapų ţaliava, atsiţvelgiant į smulkumą, atitinka Ph. Eur. augalinei ţaliavai keliamus reikalavimus.

31 Bendrojo fenolinių junginių kiekio nustatymas juodųjų serbentų lapuose ir uogų sausajame ekstrakte Pagamintas etanolinis serbentų lapų ekstraktas (1:10) (metodika skyrelyje 2.4.) Juodųjų serbentų uogų sausasis ekstraktas tirpintas išgrynintame vandenyje santykiu 1:10. Fenolinių junginių kiekis ekstraktuose nustatytas naudojant 2.6. skyriuje nurodytą metodiką, praskiedţiant juos santykiu 1:100, apskaičiuotas bendrasis fenolinių junginių kiekis lapuose ir sausajame ekstrakte, rezultatai pateikti 3 lentelėje. 3 Lentelė. Bendrasis fenolinių junginių kiekis juodųjų serbentų uogų ekstrakte ir lapų žaliavoje Bendrasis fenolinių junginių kiekis GRE mg/g Juodųjų serbentų uogų Juodųjų serbentų lapai sausasis ekstraktas 6,6±0,1 mg/g 19,9±0,03 mg/g ± standartinis nuokrypis (Δ), n=3 Nustatyta, kad juodųjų serbentų sausajame uogų ekstrakte bendrasis fenolinių junginių kiekis 6,6±0,1 GRE mg/g, lapuose 19,9±0,03 GRE mg/g. Ekstrahuojant lapus 70 proc. etanoliu ir paveikus ultragarsu 15 min., esant 24 ºC temperatūrai, gautas didesnis fenolinių junginių kiekis nei sausąjame uogų ekstrakte Antioksidacinio aktyvumo įvertinimas ekstraktuose Juodųjų serbentų uogų sausojo ekstrakto ir juodųjų serbentų lapų etanolinio ekstrakto antioksidacinis aktyvumas įvertintas spektrofometrijos metodu, naudojant DPPH laisvojo radikalo surišimo metodiką (2.7. skyrius). Tyrimo rezultatai pateikti 4 lentelėje. 4 Lentelė. Juodųjų serbentų ekstraktų antioksidacinis aktyvumas (proc.) Lapų etanolinis ekstraktas (1:100) Uogų ekstrakto vandeninis tirpalas (1:10) DPPH laisvojo radikalo surišimas 40,98 ± 0,07 % 65,15 ± 0,48 % ± standartinis nuokrypis (Δ), n=3

32 ekstraktas. 32 Gauti rezultatai rodo, kad stipresnėmis antioksidacinėmis savybėmis pasiţymėjo sausasis uogų 3.4. Sirupų gamyba Mokslinės literatūros duomenimis juodųjų serbentų uogų ekstraktas, kurio koncentracija siekia vos 1 proc., sėkmingai inhibuoja RSV, kuris būna daţna naujagimių ir kūdikių apatinių kvėpavimo takų infekcijų prieţastimi, gripo A bei B viruso atmainų ir Herpes simplex-1 virusų, replikaciją. Vokietijoje nustatyta, kad juodųjų serbentų lapų ekstraktas, kurio koncentracija 0,2 mg/ml, visiškai inhibuoja virusą H1N1, yra veiksmingas ir netoksiškas iki 100 mg/ml [7, 9]. Atsiţvelgiant į tai, pasirinkta sirupų sudėtis. Pagaminti keturių sudėčių sirupai su juodųjų serbentų sausuoju uogų ir etanoliniu lapų ekstraktais, bei lyginamasis cukraus sirupas. Sirupų sudėtys pateiktos 5 lentelėje. 5 Lentelė. Sirupų sudėtis procentais Sirupas C Sirupas L1 Sirupas L2 Sirupas L5 Sirupas U5 Cukrus 64,0 64,0 64,0 64,0 64,0 Ekstraktas - 1,0 lapų etanolinio ektrakto Konservantas kalio sorbatas Išgrynintas vanduo 2,0 lapų etanolinio ekstrakto 5,0 lapų etanolinio ekstrakto 5,0 sausojo uogų ekstrakto 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 35,8 34,8 33,8 30,8 30,8 Kiekvienos sudėties sirupo pagaminta po 4 ekspermentinius pavyzdţius. Sirupai su lapų ekstraktais ţymimi L1, L2, L5, sirupas su sausuoju uogų ekstraktu - U5, cukraus sirupas ţymėtas C Bendrojo fenolinių junginių kiekio nustatymas sirupuose Nustatytas bendrasis fenolinių junginių kiekis pagal galo rūgštį pagamintuose sirupuose pagal metodiką, nurodytą skyriuje 2.6. Rezultatai pateikti 6 lentelėje.

33 33 6 lentelė. Bendrasis fenolinių junginių kiekis sirupuose Sirupas Kiekis GRE mg/ml L1 3,07 ± 0,02 L2 4,03 ± 0,04 L5 7,36 ± 0,015 U5 6,21 ± 0,03 ± standartinis nuokrypis (Δ), n=3 Bendrasis fenolinių junginių kiekis sirupuose priklauso nuo pridėto ekstrakto kiekio. Sirupe, kurio sudėtyje 5 proc. juodųjų serbentų lapų etanolinio ekstrakto, nustatytas didesnis fenolinių junginių kiekis nei sirupe su 5 proc sausojo uogų ekstrakto Antioksidacinių savybių nustatymas sirupuose Antioksidacinis tiriamųjų sirupų aktyvumas įvertintas DPPH laisvojo radikalo surišimo metodu, aprašytu skyriuje 2.7. Matavimai atlikti pagaminus sirupus. Duomenys pateikti 7 lentelėje. 7 lentelė. Antioksidacinis sirupų aktyvumas Sirupas Antioksidacinis aktyvumas (%) L1 23,77±0,09 L2 37,15 ±0,15 L5 51,45 ±0,21 U5 69,95 ±0,12 ± standartinis nuokrypis (Δ), n=3 Nustatyta kad antioksidacinis aktyvumas sirupuose didėja priklausomai nuo pridėto ektrakto kiekio. Sirupas su 5 proc. juodųjų serbentų sausojo uogų ekstrakto pasiţymėjo stipriausiomis antioksidacinėmis savybėmis, nors buvo 10 kartų labiau praskiestas, nei sirupai pagaminti su etanoliniais lapų ekstraktais. Bendrojo fenolinių junginių kiekio ir antioksidacinio aktyvumo palyginimas pateiktas 6 paveiksle.

34 % GREmg/ml Antioksidacinis aktyvumas % Fenoliniai junginiai GRE mg/ml L1 L2 L5 U5 0 6 pav. Bendrasis fenolinių junginių kiekis ir antioksidacinis aktyvumas sirupuose (n=3) Įvertinus sirupų, su juodųjų serbentų ekstraktais, antioksidacinį aktyvumą ir bendrajį fenolinių junginių kiekį, pastebėta stipri koreliacija tarp fenolinių junginių kiekio ir DPPH laisvojo radikalo inaktyvinimo (r=0,8022). Sirupe L5 AA silpniausiai koreliuoja su bendruoju fenolinių junginių kiekiu. Didesnį sirupo, su sausuoju uogų ekstraktu, antioksidacinį aktyvumą galima aiškinti dideliu antocianinų kiekiu, esančiu serbentų uogose [38] Sirupų klampos tyrimai Nustatyta tiriamųjų ir cukraus sirupų dinaminė klampa viskozimetru Sine wave Vibro Viscometer SV 10 (Japonija). Naudota metodika, kuri aprašyta skyriuje 2.8. Rezultatai pateikti 7 paveiksle mpa*s C L1 L2 L5 U5 Klampa (20C ) 7 pav. Sirupų klampos reikšmės (n=3)

35 35 Išanalizavus tyrimo duomenis, pastebima, kad ekstraktai, pridėti į sirupus, reikšmingai padidina sirupų klampą. Tyrimas parodė, kad sirupas su sausuoju uogų ekstraktu pasiţymėjo didesne klampa nei sirupai su etanoliniu lapų ekstraktu Lūžio rodiklio vertinimas Lūţio rodiklis refraktometru nustatytas cukraus ir tiriamuosiuose serbentų lapų sirupuose, pagal metodiką aprašytą skyriuje 2.9. Gauti rezultatai pateikti 8 lentelėje. Sirupas 8 Lentelė. Sirupų lūžio rodikliai Lūžio rodiklis C 1,4450±0,0001 L1 1,4450±0,0001 L2 1,4471±0,0003 L5 1,4483±0,0001 ± standartinis nuokrypis (Δ), n=3 Nustačius pagamintų sirupų lūţio rodiklius, matomas neţymus jo padidėjimas: pridėjus 1 proc. etanolinio juodųjų serbentų ekstrakto, lūţio rodiklis padidėjo 0,07 proc. Sirupe su 5 proc. etanolinio lapų ekstrakto nustatytas 0,3 proc. lūţio rodiklio padidėjimas, lyginant su cukraus sirupu. Sirupo su sausuoju uogų ekstraktu lūţio rodiklis buvo neišmatuojamas Sirupų tankio vertinimas lentelėje. Pagamintų sirupų tankis nustatytas pagal skyriuje pateiktą metodiką. Rezultatai pateikti 9

36 36 9 Lentelė. Sirupų santykinis tankis Sirupas Tankis, g/cm³ C 1,301 ± 0,009 L1 1,304 ± 0,007 L2 1,307 ± 0,008 L5 1,310 ± 0,009 U5 1,328 ± 0,011 ± standartinis nuokrypis (Δ), n=3. Įvertinus tiriamųjų sirupų santykinį tankį stebimas jo didėjimas, didėjant ekstrakto kiekiui. Sirupo, kurio sudėtyje yra 5 proc. sausojo juodųjų serbentų uogų ekstrakto, tankis didţiausias Optinio tankio ir cukraus koncentracijos vertinimas Naudojant poliarimetrą ir metodiką, aprašytą skyriuje, įvertintas sirupų optinis tankis ir cukraus koncentracija. Tyrimo rezultatai pateikti 10 lentelėje. 10 Lentelė. Sirupų optinis tankis ir cukraus koncentracija Sirupas Optinis tankis A589 nm Cukraus koncentracija proc. C 41,742 ± 0,012 64,0020 ± 0,002 L1 42,584 ± 0,019 63,9920 ± 0,004 L2 42,798 ± 0,020 63,9898 ± 0,002 L5 42,988 ± 0,010 63,9750 ± 0,003 ± standartinis nuokrypis (Δ), n=3 Poliarimetrijos metodu nustatyta cukraus koncentracija sirupuose yra intervale 63, ,0020 proc. Optinis tankis pagamintuose sirupuose nuo 41,742 ± 0,012 iki 42,988± 0,010. Optinis sirupo tankis yra nuo cukraus koncentracijos priklausomas dydis, rodantis maţiausius cukraus koncentracijos pokyčius.

37 Sirupų stabilumo tyrimas Atsiţvelgiant į sirupų laikymo sąlygas vaistinėje ar namuose, jų stabilumas vertintas laikant juos įprastomis sąlygomis, 21±2 C temperatūroje, tamsioje vietoje. Sirupų kokybės tyrimai buvo atlikti pagaminus sirupus, po vieno ir po dviejų mėnesių. Tirti antioksidacinio aktyvumo, bendrojo fenolinių junginių kiekio, klampos, santykinio tankio, lūţio rodiklio ir optinio tankio pokyčiai laikymo metu. Gauti rezultatai pateikti ţemiau esančiuose paveiksluose. Taip pat vertintas sirupų stabilumas, laikant juos ypatingomis sąlygomis. Pagaminti sirupai mėnesiui patalpinti į klimatinę kamerą, kurioje temperatūra 30±2 С, o santykinė drėgmė 70±5 proc. Konservantas kalio sorbatas (koncentracija 0,2 proc.) uţtikrino pagamintų preparatų stabilumą viso tyrimo metu. Laikant sirupus laboratorijos sąlygomis (21±2 C temperatūroje) ir klimatinėje kameroje (30±2 С temperatūra, 70±5 proc. santykinė drėgmė) jų spalva, konsistencija, skaidrumas ir kvapas nepakito. Gauti stebėjimo rezultatai pateikti ţemiau esančiuose paveiksluose Sirupų kokybės pokyčiai, laikant įprastomis sąlygomis (21±2 C temperatūroje) Nustatyti AA pokyčiai sirupuose ilgalaikio stabilumo tyrimo metu. Rezultatai pateikti 8 paveiksle. 8 pav. Sirupų antioksidacinio aktyvumo kitimas (laikant 21±2 C temperatūroje)(n=3) Antioksidacinis sirupų aktyvumas ilgalaikio stabilumo tyrimo metu kito nereikšmingai. Maţiausias pokytis stebimas sirupe su 5 proc. etanolinio juodųjų serbentų lapų ekstrakto, antioksidacinis

38 38 aktyvumas sumaţėjo 0,54 proc. Sirupe su 5 proc. sausojo uogų ekstrakto 0,66 proc. Didţiausias antioksidacinio aktyvumo pokytis nustatytas sirupe su 1 proc. etanolinio lapų ekstrakto 2,51 proc. Šie pokyčiai statistiškai nebuvo reikšmingi. Nustatyti bendrojo fenolinių junginių kiekio pokyčiai laikant sirupus įprastomis sąlygomis. Rezultatai pateikti 9 paveiksle. 9 pav. Bendrojo fenolinių junginių kiekio kitimas sirupuose (laikant 21±2 C temperatūroje) (n=3) Bendrasis fenolinių junginių kiekis per du mėnesius labiausiai sumaţėjo sirupe pagamintame su 1 proc. etanoliniu juodųjų serbentų lapų ekstraktu (4,54 proc.). Stabiliausi, vertinant šiuo aspektu, išliko sirupai turintys 5 proc. etanolinio juodųjų serbentų lapų ekstrakto (bendrasis fenolinių junginių kiekis sumaţėjo 0,43 proc.) ir 5 proc. sausojo uogų ekstrakto (sumaţėjo 1,93 proc.). Bendrasis fenolinių junginių kiekis sumaţėjo visuose sirupuose, tačiau neviršyjo 10 proc. Veikliųjų medţiagų grupės pokytis ±10 proc. rodo preparato nestabilumą [60]. Sirupų klampos pokyčiai stabilumo tyrimo metu, laikant sirupus tamsioje vietoje, 21±2 C temperatūroje, pateikti 10 paveiksle.

39 Santykinis tankis g/cm³ Klampa mpa*s Pagaminus Po 1 mėnesio Po 2 mėnesių Sirupas C sirupas L1 Sirupas L2 Sirupas L5 Sirupas U5 10 pav. Sirupų klampos kitimas (laikant 21±2 C temperatūroje) (n=3) Laikant sirupus 21±2 C temperatūroje, pastebimas klampos didėjimas sirupuose su juodųjų serbentų lapų etanoliniais ekstraktais, lyginant su pradinėmis reikšmėmis. Sirupe su juodųjų serbentų sausuoju uogų ekstraktu klampa maţėjo. Tačiau klampos pokyčiai tiriamuosiuose objektuose laikymo metu buvo statistiškai nereikšmingi. Nustatyti santykinio tankio pokyčiai sirupuose stabilumo tyrimo metu, per du mėnesius. Rezultatai pateikti 11 paveiksle. 1,335 1,33 1,325 1,32 1,315 1,31 1,305 1,3 1,295 1,29 1,285 Pagaminus Po 1 mėnesio Po 2 mėnesių Sirupas C Sirupas L1 Sirupas L2 Sirupas L5 Sirupas U5 11 pav. Sirupų tankio kitimas stabilumo tyrimo metu (laikant 21±2 C temperatūroje) (n=3) pav.). Santykinis tankis per du mėnesius, laikant sirupus įprastomis sąlygomis, kito nereikšmingai (11 Sirupų lūţio rodiklio pokyčiai stabilumo tyrimo metu pateikti 12 paveiksle.

40 Optinis tankis Lūžio rodiklis 40 1,449 1,448 1,447 1,446 1,445 1,444 Sirupas C Sirupas L1 Sirupas L2 Sirupas L5 1,443 Pagaminus Po 1 mėnesio Po 2 mėnesių 12 pav. Sirupų lūžio rodiklio kitimas stabilumo tyrimo metu (laikant 21±2 C temperatūroje) (n=3) Refraktometru įvertinus sirupų lūţio rodiklius, po dvejų mėnesių, nustatytas pokytis visuose sirupuose apie 0,2 proc. lyginant su pradinėmis reikšmėmis, nepriklausomai nuo pridėto ekstrakto rūšies ar kiekio. Optinio tankio pokyčiai sirupuose, laikant juos įprastomis sąlygomis pateikti 13 paveiksle. 43, , ,5 41 Sirupas C Sirupas L1 Sirupas L2 Sirupas L5 40,5 Pagaminus Po 1 mėnesio Po 2 mėnesių 13 pav. Sirupų optinio tankio kitimas stabilumo tyrimo metu (laikant 21±2 C temperatūroje) (n=3) Optinis tankis viso tyrimo metu kito nereikšmingai (p>0,05). Stabilumo tyrimo metu, laikant sirupus 21±2 С temperatūroje, sandariai uţdarytuose tamsaus stiklo buteliukuose du mėnesius, jų fizikinės savybės keitėsi nereikšmingai, AA ir bendrasis fenolinių junginių kiekis laikymo metu maţiau pakito sirupuose su didesne ekstraktų koncentracija. Kitos

41 41 fizikinės savybės kito neţymiai, nepriklausomai nuo pridėto ekstrakto rūšies ar kiekio, todėl galima teigti, kad preparatai viso tyrimo metu išliko stabilūs Sirupų kokybės pokyčiai, laikant juos klimatinėje kameroje Nustatytas AA sirupuose, laikytuose klimatinėje kameroje vieną mėnesį. Rezultatai pateikti 14 paveiksle palyginant su rezultatais gautais laikant sirupus įprastomis sąlygomis. 14 pav. Antioksidacinio aktyvumo pokyčių palyginimas sirupuose (n=3) Nustačius AA sirupuose, pastebėtas didesnis jo sumaţėjimas tiriamuosiuose objektuose, laikytuose klimatinėje kameroje. Tačiau šis pokytis nėra statistiškai reikšmingas. Nustatytas bendrasis fenolinių junginių kiekis pagal galo rūgštį sirupuose, kurie laikyti klimatinėje kameroje, vieną mėnesį. Gauti rezultatai palyginti su įprastomis sąlygomis laikytų sirupų tyrimų rezultatais. Jie pateikti 15 paveiksle.

42 42 15 pav. Bendrojo fenolinių junginių kiekio pokyčių palyginimas sirupuose (n=3) Iš grafiko matomi statistiškai nereikšmingi fenolinių junginių kiekio pokyčiai sirupuose, laikant tiek klimatinėje kameroje, tiek įprastomis sąlygomis. Tyrimo metu nustatyti sirupų klampos pokyčiai laikant klimatinėje kameroje, rezultatai palyginti su įprastomis sąlygomis laikytų sirupų klampa, o tyrimų rezultatai pateikti 16 paveiksle. 16 pav. Sirupų klampos pokyčių palyginimas (n=3) Sirupų klampa, laikant juos skirtingomis sąlygomis (21±2 ºC temperatūroje ir 30±2 ºC temperatūoje, esant 70±5 proc. drėgmei) keitėsi nereikšmingai. Taip pat stebėti santykinio tankio, lūţio rodiklio ir optinio tankio pokyčiai. Rezultatai palyginti su ilgalaikio stabilumo tyrimo duomenimis ir pateikti 11 lentelėje.